マウスにおける人工関節周囲カン ジダ・アルビカンス 感染モデル

カンジダ・アルビカンス(C. albicans)は、人体の多くの部分に共生しており¹、特に免疫不全の患者において、生命を脅かす侵襲性真菌感染症を引き起こす最も一般的な日和見病原体でもあります^2,3。C.アルビカンスは、酵母と菌糸体の状態の間で多形性真菌として形質転換することができます。菌糸体の状態は、より高い病原性、より強い接着、および細胞や組織への浸潤を示します^4,5。さらに、C.アルビカンスは、義歯、カテーテル、ステントなどの生物医学材料の表面にバイオフィルムを形成する可能性があります^1,6,7。バイオフィルムの緻密な三次元構造は、抗真菌薬の浸潤を制限し、薬剤耐性遺伝子を発現し、真菌細胞の代謝をダウンレギュレートして免疫系のクリアランスに抵抗する^6,7。したがって、バイオフィルム関連の感染症は、診療所で非常に^{困難です8。}

黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、およびエンテロバクターは、PJI⁹を引き起こす主な病原体です。真菌PJIの発生率は比較的低い(約1%)^が10が、真菌PJIの治療費は高く¹¹、治療サイクルは長く¹¹、治療成功率は細菌PJIよりも低い¹⁰。近年、真菌性PJIの発生率は年々増加しています¹⁰。カンジダPJIは真菌PJIの77%〜84%を占め、^10,12、C.アルビカンスはカンジダで最も一般的です(54%)。したがって、真菌PJIを研究する必要があります。

現在、PJIは、(1)感染したインプラントの除去、(2)創面切除、(3)抗菌治療、(4)再移植による再移植手術による治療を行っています。徹底的な創面切除の後、骨セメントを含む抗生物質が配置され、患者は抗生物質で6週間以上全身的に治療され、感染を効果的に制御してから、新しいインプラントが配置されます¹³。しかし、この方法では組織内の病原体を完全に排除することはできず、長期の抗菌薬療法で治療された再発性感染症は、薬剤耐性株で発症する可能性が高くなります14,15,16。

PJIの動物モデルを確立することは、PJIの新薬や治療薬の研究開発にとって重要です。PJIの発症では、プロテーゼの周囲に大きなデッドスペースが形成され、血腫の形成につながり、周囲の組織の血液供給をさらにブロックし、抗生物質の効果を損ないます^11,15。プロテーゼの周囲環境を模倣することが困難なため、従来の動物モデルではPJI^17,18の実際の状況を正確にシミュレートすることはできません。

この論文では、マウスのC.アルビカンスバイオフィルム関連PJIモデルが、臨床的に広く使用されているチタンニッケルワイヤーを使用して構築され、関節インプラントをシミュレートしました^19,20。このPJIモデルは、操作が簡単で、成功率が高く、再現性が高く、臨床的相関が高いという利点があります。本研究は、C. albicansバイオフィルム関連PJIの予防と治療を研究するための重要なモデルとなることが期待されます。

動物は西安交通大学から購入しました。すべての動物実験手順は、西安交通大学の動物倫理委員会によって承認されました(承認番号:SCXK[陝西]2021-103)。マウスを1ケージあたり5匹で1週間飼育した。彼らは食料と水を自由に手に入れることを許された。動物は、研究が実施される前に、室温(RT;24°C±1°C)および明暗サイクル(12時間/12時間)に維持されました。

1. バッファーと機器の準備

1. C. albicansの 細胞培養
   1. 酵母抽出物ペプトンデキストロース(YPD)プレート培地から、接種ループを備えた C.アルビカンス (SC5314)のモノクローナルコロニーを5 mLのYPD液体培地(YPD + 50 μg/mLカルベニシリン)に接種します。
   2. 続いて、 C. albicans 細胞を220rpmの速度で30°Cで一晩振とうします。
   3. 懸濁液を 400 x g で 5 分間 RT で遠心分離し、C . albicans 細胞を通常の生理食塩水に再懸濁し、濁度を 0.5 McFarland と同じになるように視覚的に調整して、細胞の濃度を 1 x 10⁶ cells/mL に希釈します。
2. 生理食塩水の調製
   1. 0.9gの塩化ナトリウムを秤量し、100mLの脱イオン水に溶解して、0.9%生理食塩水を調製します。
3. 手術器具の準備
   1. 手術器具(はさみ、鉗子、止血鉗子、ニードルホルダー、縫合針)およびチタンニッケル合金線(直径約0.5mm)を使用する前に、オートクレーブ(121°C、30分)。

2. マウスPJIモデル確立

1. 30匹のC57BL/6マウス(雄、15-20g)を、対照群、ブランクインプラント群( C.アルビカン ス感染を伴わないチタンニッケルワイヤー植込み)、PJI群( C.アルビカン ス感染を伴うチタンニッケルワイヤー植込み)の3つのグループ(10匹/グループ)にランダムに分けます。
2. マウスに1〜4%のイソフルラン吸入で麻酔をかけた後、左後肢の毛を取り除き、ヨウ素で消毒します。矯正反射が失われ、つま先の刺激に反応しないことは、麻酔の深さを確認します。麻酔中は両眼に眼軟膏を塗って角膜の乾燥を防ぎ、手術中や回復中の熱を補充します。
3. 対照群のマウスには、治療を行わないでください。彼らに水と食料の無料アクセスを提供します。
4. ブランクインプラント群とPJI群のマウスの場合、#10ブレードまたは滅菌カミソリを使用して、左後肢の各膝に5mmの縦方向の切開を行い、関節を露出させます。
5. 滅菌シリンジ(26 G)針を挿入して、大腿骨髄管に長さ5 mmの穴を開けます。
6. 滑らかなニッケルチタン合金線(直径0.5mm、長さ5mm)を穴に挿入してから、はさみで切断します(図1)。
7. ブランクインプラント群のマウスには、ニッケル-チタン合金ワイヤーに沿って2 μLのYPD培地を滴下してから、ナイロン縫合糸(直径0.15 mm)を使用して創傷を層ごとに閉じます。
8. PJI群のマウスに対して、2 μLの C.アルビカンス 細胞(1 × 10⁶ cells/mL)をニッケルチタン合金ワイヤーに沿ってマウスの関節腔に1滴ずつ接種し、ナイロン縫合糸を使用して巻線を層ごとに閉じます。
9. ネズミを飼育し、14日間水と餌を自由に食べられるようにします。メロキシカムを皮下注射(4 mg / kg)で24時間ごとに最大3日間投与します。.
10. 14日後、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる前に、3%イソフルランでマウスに麻酔をかけます。.

3. PJIモデル評価

1. 主要臓器の感染評価
   1. 安楽死させた後、マウスから腎臓、肝臓、脾臓を採取します。
   2. 各臓器に滅菌生理食塩水 500 μL を加え、ホモジナイザーで 4 °C の組織を粉砕します。
   3. ステップ 3.1.2 で調製したホモジネート 100 μL を YPD プレートに加え、曲げロッドで均等に広げます。
   4. YPDプレートを反転させて37°Cのインキュベーターに48時間入れます。
   5. コロニーの数を目視で観察し、数えます。
2. インプラント上の C.アルビカンス とバイオフィルムの観察
   1. ピンセットでインプラントを採取する前に、マウスの関節の皮膚をハサミで慎重に切り取ります。
   2. インプラントを2.5%グルタルアルデヒド溶液に浸し、4°Cで48時間固定します。
   3. インプラントを滅菌PBSで3回すすぎ、1%オスミウム酸溶液に3時間浸します。
   4. インプラントを滅菌PBSで3回すすぎ、50%、70%、80%、90%、100%のエタノール溶液に15分間浸して脱水します。
   5. インプラントを凍結乾燥する前に、インプラントをtert-ブタノールに30分間3回浸漬してください。
   6. インプラントサンプルをサンプルステージに固定し、インプラントを金(10nmコーティング)でスパッタコートし、高真空、1.5kVの走査型電子顕微鏡(SEM)で観察します。
3. 大腿骨組織の病理学的分析
   1. マウスを安楽死させた後、ハサミで大腿組織を採取します。
   2. 大腿骨組織を4%パラホルムアルデヒド溶液に浸し、4°Cで48時間固定します。
   3. 大腿骨組織を10%ホルマリンに1週間入れます。
   4. 大腿骨組織をそれぞれ50%、70%、80%、90%、および100%エタノール溶液に15分間浸して脱水します。
   5. 脱水した大腿骨組織をパラフィンに包埋してから、ミクロトームを用いて組織を4 μmのサンプルに切片化します。
   6. 病理学的分析の前に、標準プロトコルに従って大腿骨切片をヘマトキシリンとエオシンで染色します²¹。

サンプルをプレート培地に移し、一晩のインキュベーション後にコロニーをカウントすることは、病変付近の局所病原体負荷を評価するために一般的に使用されます^22,23。私たちの研究では、肝臓、腎臓、および脾臓サンプルの微生物培養は陰性であり、この研究のモデルはマウスの全身感染ではなく局所感染のみを引き起こしたことを示しています²³。

インプラントのSEM画像を 図2に示します。ブランクインプラント群のニッケルチタン合金ワイヤーの表面に C.アルビカン スが付着またはコロニー形成されていません。しかし、PJI群のニッケルチタン合金線材の表面に成熟した厚いバイオフィルムが観察され、手術14日後のマウスではC . albicans バイオフィルム関連PJIモデルの構築に成功したことが示された²³。

大腿骨組織のH&E染色を 図3に示します。対照群では明確で完全な骨小柱構造が観察されましたが、ブランクインプラント群では大腿骨組織にいくつかの骨小柱組織欠損が見られました(図3、黄色の矢印)。PJI群では、骨小柱の数が有意に減少した²³。これらの結果は、大腿骨組織の重大な病理学的損傷を伴うマウスの C.albicans バイオフィルム関連PJIモデルが正常に確立されたことを示しています。

図1:移植手順。 左パネルの赤い四角は、滑らかなニッケルチタン合金ワイヤーが挿入される手術部位を示しています。右のパネルは、大腿骨の一部(赤丸)とニッケル線です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:ブランク群とPJI群のインプラント表面のSEM画像。 代表画像として倍率1000倍(スケールバー=500μm)と5000倍(スケールバー=100μm)を展示しています。この図は、Mo et ^al.23 の許可を得て変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:大腿骨組織のH&E染色。 インプラント、PJIモデル、および対照群の代表的なH&E画像を図に示します。対照群は、明確で完全な骨線維柱帯構造を示しています。ブランクインプラント群では、大腿骨組織にいくつかの骨小柱組織欠損が見られました(黄色の矢印)。しかし、PJI群では骨小柱の数が減少した。倍率は200倍(スケールバー=150μm)と400倍(スケールバー=75μm)です。この図は、Mo et ^al.23 の許可を得て変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

手術器具の汚染や手術中の手術環境によって引き起こされる感染症は、ほとんどのインプラント感染症の主な理由です^24,25,26,27。そこで、本研究ではマウスC.アルビカンスバイオフィルム関連PJIモデルを構築した。生理食塩水に懸濁した無菌ステンレス粒子をインプラントとする従来のPJIモデルに比べ、本研究では、インプラント材料として一般的に用いられるニッケルチタン合金線を用いて、C. albicansとインプラント材料、骨との接触を模擬し、より診療所に近い状態を再現しました。

この記事で説明するPJIモデルは、診療所におけるPJIの生理学的環境を完全にシミュレートできます。このモデルは、その後の血液媒介感染ではなく、移植中の感染を研究するためにのみ使用できます。

C. albicansは2つの方法で接種することができる。1つは、手術中にインプラント部位でC.アルビカンスを直接接種することであり²⁸、もう1つは、外科的移植²⁹の前にインプラントの表面に成熟したバイオフィルムが形成されるように、一定期間C.アルビカンスでインプラントを培養することです。前者の方法は、病原体の接種数が正確であるため、グループ間の差が最小限に抑えられ、その後の治療をより客観的に評価できるため、この研究では前者の方法が選択されました。さらに、前者の方法は臨床状況により一貫しています。

このプロトコルでは、インプラントの挿入を行うことは困難です。オペレーターは、インプラントが皮下または筋肉内ではなく関節に挿入されるように、数回練習する必要があります。さらに、 C. albicans の接種回数は、PJIモデルの再現性にとって重要です。 C.アルビカンスは 、接種番号の正確性を確保するために、渦を介して完全に混合する必要があります。さらに、 C.アルビカンス を合金ワイヤーに沿って追加して、臨床状況での感染経路をシミュレートする必要があります。

バイオフィルムは細菌感染の7日後に検出され、その後バイオフィルムは徐々に増加し、14^日目 にプラトーに達しました³⁰。したがって、確立されたPJIモデルの成功は14^日目 に検査されました。 C. albicans のコロニー形成とインプラント表面のバイオフィルムの形成をSEMで検査しました。局所感染によって引き起こされるインプラント周辺の組織病変は、H&E染色後の病理学的分析によって評価されました。研究によると、人工関節周囲の骨溶解はPJI³¹による重要な特徴です。したがって、これらの指標は、PJI³²の予防および治療のための治療方法を評価する上でも不可欠である。

微生物培養は、診療所や研究所で微生物感染を検出するために一般的に使用されています。そこで、本研究では、インプラント、インプラント周辺の組織、肝臓、その他の重要な臓器の微生物培養を行いました。インプラントについては、超音波処理を適用して、チタン - ニッケル合金ワイヤの表面に付着した C.アルビカンス を除去した。次に、 C. albicans は、微生物培養の前に遠心分離によって濃縮されました。しかし、SEMの結果と矛盾する陰性の結果が見つかりました(図2)。SEMの結果、チタン-ニッケル合金線の表面に C.アルビカンスが 付着していることが示されました。したがって、微生物培養の結果は偽陰性であり、これはC .アルビカンスが チタン-ニッケル合金ワイヤーにしっかりと接着したことに起因する可能性があります。超音波は、インプラントから C.アルビカンス をうまく剥離できませんでした。同様に、インプラントや重要な臓器の周りの組織の微生物培養も陰性でした。(1)本研究で接種された C.アルビカン スの数はわずか2000CFUであり、実験期間中に周囲の組織やシステムに侵入するには少なすぎる可能性があります。(2)組織から病原体を抽出・分離する方法の感度が低い。以前に発表された報告では、微生物培養が偽陰性の結果や治療の遅延を簡単に示す可能性があることが示唆されています³³。グロコット−ゴモリ染色は、骨および関節³²における菌糸の形成を決定するために用いることができる。また、手術前に接種量を増やしたり、実験期間を延長したり、マウスを免疫抑制状態に保つことも有用である可能性がある³²。ただし、長期間感染すると、深部感染や全身感染につながる可能性があることに注意する必要があります。したがって、実験期間は特定の目的に応じて設計する必要があります。

要約すると、この研究は、 C. albicans バイオフィルム関連PIJの予防と治療を研究する上で非常に重要である可能性がある、 C.albicans バイオフィルム関連PJIの成功したマウスモデルを作成しました。