Summary
위험한 병원체에 의한 보철 관절 주위 감염(PJI)은 임상 정형외과에서 흔합니다. 기존의 동물 모델로는 PJI의 실제 상황을 정확하게 시뮬레이션할 수 없습니다. 여기에서 우리는 PJI에 대한 새로운 치료제를 연구하고 개발하기 위해 Candida albicans 생물막 관련 PJI 마우스 모델을 구축했습니다.
Abstract
인공 관절 주위 감염(PJI)은 칸디다 알비칸스(C. albicans)에 의해 발생하는 흔한 감염 중 하나로, 외과 의사와 과학자들의 우려가 점점 더 커지고 있습니다. 일반적으로 C. albicans를 항생제로부터 보호하고 면역 제거를 할 수 있는 생물막이 감염 부위에 형성됩니다. 감염된 임플란트 제거, 괴사조직 제거, 항균 치료 및 재이식을 포함하는 수술은 PJI 치료의 황금 표준입니다. 따라서 동물 PJI 모델을 확립하는 것은 PJI에 대한 신약 또는 치료제의 연구 및 개발에 매우 중요합니다. 이 연구에서는 정형외과 클리닉에서 널리 사용되는 임플란트인 부드러운 니켈-티타늄 합금 와이어를 C57BL/6 마우스의 대퇴 관절에 삽입한 후 C. albicans 를 와이어를 따라 관절강에 접종했습니다. 14일 후, 성숙하고 두꺼운 생물막이 주사 전자 현미경(SEM)의 밑에 임플란트의 표면에 관찰되었습니다. 감염된 관절 표본의 H&E 염색에서 현저히 감소된 뼈 섬유주가 발견되었습니다. 요약하자면, 쉬운 조작, 높은 성공률, 높은 반복성 및 높은 임상 상관 관계의 장점을 가진 마우스 PJI 모델이 확립되었습니다. 이는 C. albicans 생물막 관련 PJI 예방의 임상 연구에 중요한 모델이 될 것으로 기대됩니다.
Introduction
칸디다 알비칸스(Candida albicans, C. albicans)는인체의 여러 부위에 공생하며1, 특히 면역력이 저하된 환자에서 생명을 위협하는 침습성 진균 감염을 일으키는 가장 흔한 기회 병원체이기도 하다 2,3. C. albicans는 효모와 균사체 상태 사이에서 다형성 균류로 변형될 수 있습니다. 균사체 상태는 더 높은 독성, 더 강한 접착력, 세포 및 조직의 침입을 나타냅니다 4,5. 게다가, C. albicans는 의치, 카테터 및 스텐트와 같은 생물 의학 재료의 표면에 생물막을 형성 할 수 있습니다 1,6,7. 생물막의 조밀한 3차원 구조는 항진균제의 침투를 제한하고, 약 저항하는 유전자를 발현하고, 면역 체계 정리에 저항하기 위하여 진균 세포의 물질 대사를 하향 통제합니다 6,7. 그러므로, 생물막 관련 감염은 클리닉에서 상당히 까다롭다(8).
황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 응고효소 음성 포도상구균(coagulase-negative staphylococcus), 엔테로박터(enterobacter)는 PJI9를 유발하는 주요 병원체입니다. 진균 PJI의 발생률은 상대적으로 낮지만(약 1%)10, 진균 PJI의 치료비용은 더 높고11, 치료 주기는 더 길고11, 치료 성공률은 박테리아 PJI보다 낮다10. 최근 몇 년 동안 곰팡이 PJI의 발생률은 해마다 증가하고 있습니다10. 칸디다 PJI는 곰팡이 PJI10,12의 77%-84%를 차지하며, C. 알비칸스는 칸디다균(54%)에서 가장 흔합니다. 따라서 곰팡이 PJI를 연구해야 합니다.
현재 PJI는 (1) 감염된 보형물 제거, (2) 괴사조직 제거, (3) 항균 치료, (4) 재이식에 의한 재수술을 통해 치료하고 있습니다. 철저한 괴사조직 제거 후 골시멘트가 함유된 항생제를 투여하고, 환자에게 6주 이상 전신 항생제를 투여하여 감염을 효과적으로 조절한 후 새로운 임플란트를 식립한다13. 그러나, 이 방법은 조직 내의 병원체를 완전히 제거할 수 없으며, 장기간의 항균 요법으로 치료된 재발성 감염은 약물 내성 균주에서 발생할 가능성이 매우 높다 14,15,16.
PJI의 동물 모델을 확립하는 것은 PJI에 대한 신약 또는 치료제의 연구 및 개발에 중요합니다. PJI의 발달 과정에서 보철물 주위에 큰 사각지대가 형성되어 혈종이 형성되어 주변 조직의 혈액 공급을 더욱 차단하고 항생제의 효과를 손상시킵니다11,15. 보철물의 주변 환경을 모방하기 어렵기 때문에 전통적인 동물 모델은 PJI17,18의 실제 상황을 정확하게 시뮬레이션할 수 없습니다.
이 논문에서, 마우스의 C. albicans 생물막 관련 PJI 모델은 임상적으로 널리 사용되는 티타늄-니켈 와이어를 사용하여 관절 임플란트를 시뮬레이션하여구성되었습니다 19,20. 이 PJI 모델은 쉬운 작동, 높은 성공률, 높은 반복성 및 높은 임상 상관 관계의 장점을 보여줍니다. C. albicans 생물막 관련 PJI의 예방 및 치료를 연구하는 데 중요한 모델이 될 것으로 기대됩니다.
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Protocol
동물들은 Xi'an Jiaotong University에서 구입했습니다. 모든 동물 실험 절차는 Xi'an Jiaotong University의 기관 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: SCXK [Shaanxi] 2021-103). 마우스는 케이지 당 5 마리의 마우스로 1 주일 동안 보관되었습니다. 그들은 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있었다. 동물은 연구가 수행되기 전에 실온(RT; 24°C ± 1°C) 및 밝은/어두운 주기(12시간/12시간)에서 유지되었습니다.
1. 완충액 및 장비 준비
- C. 알비칸스 세포 배양
- 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 플레이트 배지에서 C . 알비칸스 (SC5314)의 단클론 콜로니를 접종 루프가 있는 5mL의 YPD 액체 배지(YPD + 50μg/mL 카베니실린)에 접종합니다.
- C. albicans 세포를 밤새 30°C에서 220rpm의 속도로 흔듭니다.
- 현탁액을 RT에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. C. albicans 세포를 생리식염수에 재현탁시키고 탁도를 0.5 McFarland와 동일하게 육안으로 조정하여 세포 농도를 1 x 106 cells/mL로 희석합니다.
- 생리 식염수의 제조
- 염화나트륨 0.9g의 무게를 달고 탈이온수 100mL에 녹여 0.9% 생리식염수를 제조합니다.
- 수술 기구 준비
- 오토클레이브(121°C, 30분) 수술 기구(가위, 집게, 지혈 겸자, 바늘 홀더, 봉합 바늘) 및 티타늄-니켈 합금 와이어(직경 약 0.5mm)를 사용하기 전에.
2. 마우스 PJI 모델 구축
- 30마리의 C57BL/6 마우스(수컷, 15-20g)를 대조군, 블랭크 임플란트 그룹( C. 알비칸스 감염이 없는 티타늄-니켈 와이어 주입) 및 PJI 그룹( C. 알비칸스 감염을 통한 티타늄-니켈 와이어 이식)의 3개 그룹(10마리/그룹)으로 무작위로 나눕니다.
- 왼쪽 뒷다리의 털을 제거하고 요오드로 소독하기 전에 1-4% 이소플루란 흡입으로 쥐를 마취시킵니다. 발가락 자극에 대한 반응이 없고 직립 반사가 없어지면 마취의 깊이가 확인됩니다. 마취 중에 양쪽 눈에 안과 연고를 바르면 각막 건조를 예방하고 수술 및 회복 중에 열을 보충할 수 있습니다.
- 대조군의 마우스의 경우 치료를 제공하지 마십시오. 물과 음식을 무료로 이용할 수 있도록 하십시오.
- 빈 임플란트 그룹과 PJI 그룹의 마우스의 경우 #5 블레이드 또는 멸균 면도기로 각 왼쪽 뒷다리의 무릎을 10mm 세로로 절개하여 관절을 노출시킵니다.
- 멸균 주사기(5G) 바늘을 삽입하여 대퇴골 골수내 운하에 26mm 길이의 구멍을 만듭니다.
- 가위로 자르기 전에 부드러운 니켈-티타늄 합금 와이어(직경 0.5mm, 길이 5mm)를 구멍에 삽입합니다(그림 1).
- 블랭크 임플란트 그룹의 마우스의 경우 나일론 봉합사(직경 0.15mm)를 사용하여 상처를 층별로 봉합하기 전에 니켈-티타늄 합금 와이어를 따라 2μL의 YPD 배지를 한 방울씩 추가합니다.
- PJI 그룹의 마우스의 경우, 나일론 봉합사를 사용하여 상처를 층별로 봉합하기 전에 니켈-티타늄 합금 와이어를 따라 마우스의 관절 공간에 2μL의 C. 알비칸스 세포(1 × 106 cells/mL)를 한 방울씩 접종합니다.
- 14일 동안 물과 음식을 무료로 이용할 수 있는 쥐를 사육합니다. 멜록시캠을 최대 3일 동안 24시간마다 피하주사(4mg/kg)로 투여합니다.
- 14일 후, 자궁경부 탈구로 생쥐를 안락사시키기 전에 3% 이소플루란으로 생쥐를 마취시킨다.
3. PJI 모델 평가
- 주요 장기의 감염 평가
- 안락사 후 쥐의 신장, 간, 비장을 채취합니다.
- 각 장기에 500μL의 멸균 생리식염수를 넣고 4°C의 균질기에서 조직을 분쇄합니다.
- 3.1.2단계에서 준비한 균질액 100μL를 YPD 플레이트에 첨가한 후 구부러진 막대로 고르게 펼칩니다.
- YPD 플레이트를 37°C 인큐베이터에 거꾸로 놓고 48시간 동안 넣습니다.
- 콜로니의 수를 시각적으로 관찰하고 계산합니다.
- 임플란트의 C. albicans 및 생물막 관찰
- 핀셋으로 임플란트를 수집하기 전에 가위로 쥐 관절 위의 피부를 조심스럽게 자릅니다.
- 임플란트를 2.5% 글루타르알데히드 용액에 담가 4°C에서 48시간 동안 고정합니다.
- 임플란트를 멸균 PBS로 세 번 헹구고 1% 오스뮴산 용액에 3시간 동안 담그십시오.
- 탈수를 위해 50, 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올 용액에 15분 동안 담그기 전에 멸균 PBS로 임플란트를 세 번 헹굽니다.
- 임플란트를 동결 건조하기 전에 30분 동안 tert-butanol에 3회 담근 상태로 유지합니다.
- 임플란트 샘플을 샘플 스테이지에 고정하고 임플란트를 금(10nm 코팅)으로 스퍼터 코팅한 다음 고진공 및 1.5kV에서 주사 전자 현미경(SEM)으로 관찰합니다.
- 대퇴골 조직의 병리학적 분석
- 쥐를 안락사 한 후 가위로 대퇴 조직을 수집하십시오.
- 대퇴골 조직을 4% 파라포름알데히드 용액에 담가 4°C에서 48시간 동안 고정합니다.
- 대퇴골 조직을 10% 포르말린에 1주일 동안 담그십시오.
- 대퇴골 조직을 각각 50, 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올 용액에 15분 동안 담가 탈수합니다.
- 마이크로톰을 사용하여 조직을 4μm 샘플로 절단하기 전에 탈수된 대퇴골 조직을 파라핀에 삽입합니다.
- 병리학적 분석 전에 표준 프로토콜에 따라 hematoxylin과 eosin으로 대퇴골 절편을 염색합니다21.
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Representative Results
샘플을 플레이트 배지로 옮기고 하룻밤 배양 후 콜로니를 계수하는 것은 일반적으로 병변22,23 근처의 국소 병원체 부하를 평가하는 데 사용됩니다. 본 연구에서, 간, 신장 및 비장 샘플의 미생물 배양은 음성이었으며, 이는 본 연구의 모델이 마우스에서 전신 감염 대신 국소 감염만을 유발했음을 나타낸다23.
임플란트의 SEM 이미지는 그림 2에 나와 있습니다. 빈 임플란트 그룹의 니켈-티타늄 합금 와이어 표면에 C. albicans가 부착되거나 식민지화되지 않았습니다. 그러나, PJI 그룹의 니켈-티타늄 합금 와이어의 표면에서 성숙하고 두꺼운 바이오필름이 관찰되었으며, 이는 수술 후 14일 후에 마우스에서 C. 알비칸스 바이오필름 관련 PJI 모델의 성공적인 구축을 나타낸다23.
대퇴 조직의 H&E 염색은 그림 3에 나와 있습니다. 대조군에서는 명확하고 완전한 골섬유주 구조가 관찰된 반면, 빈 임플란트군에서는 대퇴골 조직의 몇 가지 골섬유주 조직 결손이 관찰되었습니다(그림 3, 노란색 화살표). PJI 그룹에서는 골섬유주 수가 유의하게 감소했다23. 이러한 결과는 마우스에서 C. albicans 생물막 관련 PJI 모델이 대퇴골 조직의 상당한 병리학적 손상으로 성공적으로 확립되었음을 나타냅니다.
그림 1: 이식 절차. 왼쪽 패널의 빨간색 사각형은 부드러운 니켈-티타늄 합금 와이어가 삽입된 수술 부위를 나타냅니다. 오른쪽 패널은 니켈 와이어가 있는 대퇴골(빨간색 원)의 일부를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 블랭크 및 PJI 그룹의 임플란트 표면의 SEM 이미지. 배율 1000x(스케일 바=500μm)와 5000x(스케일 바=100μm)가 대표 이미지로 표시됩니다. 이 그림은 Mo et al.23의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대퇴골 조직의 H&E 염색. 임플란트의 대표적인 H&E 이미지, PJI 모델 및 대조군이 그림에 나와 있습니다. 대조군은 명확하고 완전한 골섬유주 구조를 보여줍니다. 빈 임플란트 그룹은 대퇴골 조직에서 몇 개의 뼈 섬유주 조직 결함(노란색 화살표)을 표시했습니다. 그러나 PJI 그룹에서 골섬유주 수가 감소했다. 표시된 배율은 200x(스케일 바 = 150μm) 및 400x(스케일 바 = 75μm)입니다. 이 그림은 Mo et al.23의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
수술 기구의 오염이나 수술 중 수술 환경으로 인한 감염은 대부분의 임플란트 감염의 주요 원인이다 24,25,26,27. 따라서 본 연구에서는 마우스 C. albicans 생물막 관련 PJI 모델을 구성하였다. 식염수에 현탁된 멸균 스테인리스강 입자를 임플란트로 사용한 기존 PJI 모델과 비교하여 본 연구에서는 일반적으로 사용되는 임플란트 재료인 니켈-티타늄 합금 와이어를 사용하여 임플란트 재료인 C. albicans와 뼈 사이의 접촉을 시뮬레이션했으며, 이는 클리닉의 상황과 더 유사합니다.
이 기사에서 설명하는 PJI 모델은 클리닉에서 PJI의 생리학적 환경을 완벽하게 시뮬레이션할 수 있습니다. 이 모델은 나중에 혈액 매개 감염이 아닌 착상 중 감염을 연구하는 데만 사용할 수 있습니다.
C. 알비칸은 두 가지 방법으로 접종할 수 있습니다. 하나는 수술 중 임플란트 부위에 C. 알비칸을 직접 접종하는 것이고(28), 다른 하나는 외과적 이식 전에 임플란트 표면에 성숙한 생물막이 형성되도록 일정 기간 동안 C. 알비칸으로 임플란트를 배양하는 것이다(29). 전자의 방법은 병원균의 정확한 접종 수로 인해 이 연구에서 선택되었으며, 이는 그룹 간의 차이를 최소화하고 후속 치료에 대한 보다 객관적인 평가를 가져왔습니다. 또한 전자의 방법이 임상 상황과 더 일치합니다.
이 프로토콜에서는 임플란트 삽입이 어렵습니다. 시술자는 임플란트가 피하 또는 근육 주사가 아닌 관절에 삽입되도록 여러 번 연습해야 합니다. 또한, C. albicans의 접종 횟수는 PJI 모델의 반복성에 매우 중요합니다. C. 알비칸은 접종 횟수의 정확성을 보장하기 위해 소용돌이를 통해 완전히 혼합되어야 합니다. 또한 C. albicans 는 임상 상황에서 감염 경로를 시뮬레이션하기 위해 합금 와이어를 따라 추가되어야 합니다.
생물막은 세균 감염 후 7일 후에 검출될 수 있으며, 그 후 생물막이 점차적으로 증가하여30일째 되는 14일에 고원에 도달했습니다. 따라서 확립 된 PJI 모델의 성공은 14일째에 검사되었습니다. C. albicans의 집락화와 임플란트 표면의 생물막 형성은 SEM에 의해 검사되었습니다. 국소 감염으로 인한 임플란트 주변의 조직 병변은 H&E 염색 후 병리학적 분석으로 평가되었습니다. 연구에 따르면 PJI31로 인해 보철 주위 골용해술이 중요한 특징입니다. 따라서 이러한 지표는 PJI32의 예방 및 치료를 위한 치료 방법을 평가하는 데에도 중요합니다.
미생물 배양은 일반적으로 클리닉 및 실험실에서 미생물 감염을 감지하는 데 사용됩니다. 따라서 본 연구에서는 임플란트의 미생물 배양, 임플란트 주변 조직, 간 및 기타 중요한 장기를 수행하였다. 임플란트의 경우, 티타늄-니켈 합금 와이어의 표면에 부착 된 C. albicans를 제거하기 위해 초음파가 적용되었습니다. 다음으로, C. albicans 는 미생물 배양 전에 원심분리에 의해 농축되었습니다. 그러나 SEM 결과와 일치하지 않는 음성 결과가 발견되었습니다(그림 2). SEM 결과는 C. albicans가 티타늄-니켈 합금 와이어의 표면에 부착되었음을 보여주었습니다. 따라서 미생물 배양의 결과는 위음성이었으며, 이는 티타늄-니켈 합금 와이어에 대한 C. albicans의 단단한 접착에 기인할 수 있습니다. 초음파는 임플란트에서 C. albicans의 각질을 성공적으로 제거할 수 없었습니다. 마찬가지로, 임플란트와 중요한 장기 주변 조직의 미생물 배양 또한 음성이었습니다. 두 가지 가능한 이유가 있습니다: (1) 이 연구에서 접종된 C. albicans의 수는 2000 CFU에 불과했으며, 이는 실험 기간 동안 주변 조직과 시스템을 침범하기에는 너무 작을 수 있습니다. (2) 조직에서 병원체를 추출하고 분리하는 방법의 민감도가 낮다. 이전에 발표된 보고서에 따르면 미생물 배양은 위음성 결과를 쉽게 나타내고 치료가 지연될 수 있음을 시사한다33. Grocott-Gomori 염색은 뼈 및 관절32에서 균사의 형성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 접종량을 늘리거나, 실험 기간을 연장하거나, 수술 전에 마우스를 면역억제 상태로 유지하는 것도 도움이 될 수 있다32. 그러나 장기간 감염되면 심부 감염 또는 전신 감염으로 이어질 수 있습니다. 따라서 실험 기간은 특정 목적에 따라 설계되어야 합니다.
요약하면, 이 연구는 C. albicans 생물막 관련 PIJ의 예방 및 치료를 연구하는 데 큰 의미가 있을 수 있는 C. albicans 생물막 관련 PJI의 성공적인 마우스 모델을 만들었습니다.
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Disclosures
저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알지 못한다고 선언합니다.
Acknowledgments
산시성 자연과학재단(보조금 번호 2021SF-118)과 중국 국립자연과학재단(보조금 번호 81973409, 82204631)의 재정적 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 Mactutrius turbidibris | Shanghai Lujing Technology Co., Ltd | 5106063 | |
| 4 °C refrigerator | Electrolux (China) Electric Co., Ltd | ESE6539TA | |
| Agar | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-023 | |
| Analytical balances | Shimadzu | ATX124 | |
| Autoclaves Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Carbenicillin | Amresco | C0885 | |
| Eclipse Ci Nikon upright optical microscope | Nikon | Eclipse Ts2-FL | |
| Glucose | Macklin | D823520 | |
| Inoculation ring | Thermo Scientific | 251586 | |
| Isoflurane | RWD | 20210103 | |
| NaCl | Xi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd | 20180108 | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | |
| Peptone | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-001 | |
| RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine | RWD | R550 | |
| SEM | Hitachi | TM-1000 | |
| Temperature incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd | ZQTY-50N | |
| Ultrapure water water generator | Heal Force | NW20VF | |
| Ultrasound machine | Do-Chrom | DS10260D | |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021B |
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