Levande kalciumavbildning av virusinfekterade humana tarmorganoidmonolager med hjälp av genetiskt kodade kalciumindikatorer

Kalcium är en allmänt bevarad andra budbärare som spelar en avgörande roll för att reglera cellulär fysiologi¹. Med tanke på dess starka laddning, lilla storlek och höga löslighet under fysiologiska förhållanden är kalcium en idealisk manipulator av proteinkonformation. Detta gör kalcium till ett kraftfullt sätt att omvandla elektrokemiska signaler till enzymatiska, transkriptionella eller post-transkriptionella förändringar. De strikta kalciumkoncentrationsgradienterna över det endoplasmatiska nätverket (ER) och plasmamembranen skapar en hög drivkraft som möjliggör snabba förändringar i cytosolisk kalciumkoncentration. Flera mekanismer, inklusive både buffring och aktiv transport, upprätthåller den här gradienten strikt. Även om det är nödvändigt för normala cellulära funktioner, är detta underhåll energimässigt dyrt, vilket gör det särskilt känsligt i stresstillstånd ².

Som sådan är dysreglering av kalcium i cytosolen en nästan universell signal om många typer av cellulär stress. Metaboliska störningar, toxiner, patogener, mekaniska skador och genetiska störningar kan alla störa kalciumsignaleringen. Oavsett stimulans kan ihållande, okontrollerade ökningar av cytosoliskt kalcium på helcellsnivå främja apoptos och så småningom nekros ^3,4. Förändringar i cytosoliska kalciumnivåer med lägre amplitud eller högre frekvens har dock varierande effekter². På samma sätt kan resultaten av kalciumfluktuationer skilja sig åt beroende på den rumsliga mikrodomän där de förekommer⁵. Övervakning av kalciumnivåer kan därför ge insikt i dynamiska signaleringsprocesser, men detta kräver provtagning med relativt hög tidsmässig och rumslig upplösning.

Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) är kraftfulla verktyg för kontinuerlig provtagning i levande cellsystem⁶. Några av de mest använda GECI:erna är GFP-baserade kalciumresponsiva fluorescerande proteiner som kallas GCaMPs⁷. Den kanoniska GCaMP är en sammansmältning av tre distinkta proteindomäner: en cirkulärt permuterad GFP (cpGFP), kalmodulin och M13⁶. Kalmodulindomänen genomgår en konformationsförändring vid bindning av kalcium, vilket möjliggör dess interaktion med M13. Calmodulin-M13-interaktionen inducerar en konformationsförändring i cpGFP som ökar dess fluorescerande emission vid excitation. Som sådan korrelerar en ökning av kalciumkoncentrationen med en ökning av GCaMP-fluorescensintensiteten. Dessa sensorer kan vara cytosoliska eller riktade mot specifika organeller⁸.

I likhet med de flesta vävnader reglerar kalcium en mängd olika funktioner i mag-tarmepitelet. Tarmepitelet är integrerat för närings- och vätskeabsorption men måste också bilda en tät barriär och immungränssnitt för att undvika patogeninvasion eller giftiga förolämpningar. Kalciumberoende vägar påverkar nästan alla dessa vitala funktioner ^9,10,11. Kalciumsignalering i tarmepitelet är dock fortfarande ett underutforskat område med lovande potential som terapeutiskt mål. Medan övervakning av kalciumdynamik i tarmepitelet in vivo fortsätter att innebära utmaningar, erbjuder mänskliga tarmorganoider (HIO) ett anpassningsbart ex vivo-system för experiment¹². HIO:er är 3-dimensionella (3D) sfäroider som härrör från mänskliga tarmstamceller och som vid differentiering rekapitulerar mycket av den cellulära mångfalden i det ursprungliga tarmepitelet¹².

Detta protokoll beskriver omfattande metoder för att konstruera HIO:er som uttrycker GECI:er och sedan förbereda konstruerade HIO:er som monolager för kalciumavbildning i levande celler. Den erbjuder virusinfektion som ett exempel på en patologisk manipulation som stör kalciumsignalering och ger ett analytiskt tillvägagångssätt för att kvantifiera dessa förändringar.

Alla mänskliga tarmorganoider (HIO) som används i detta protokoll och de representativa experimenten härrör från mänsklig vävnad som erhållits och underhållits av Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Alla prover samlades in i enlighet med ett protokoll som godkänts av Institutional Review Board vid Baylor College of Medicine.

1. Beredning av material och reagenser

1. För organoidunderhåll, samla cellkulturbehandlade 24-brunnsplattor, basalmembranmatris (BMM), 15 ml koniska rör och 1,5 ml koniska rör.
   1. För att förbereda kompletta medier utan tillväxtfaktorer (CMGF-), till 500 ml avancerad DMEM F12 tillsätt 5 ml 1M HEPES, 5 ml 100x antibiotika-antimykotika, 5 ml 100x glutamintillskott.
   2. För att bereda Wnt-, R-spondin- och Noggin-innehållande (WRNE) medier, blanda lika delar CMGF- och Wnt-konditionerade medier, tillsätt Noggin-konditionerat medium, 10 volymprocent, R-spondin-konditionerat medium, 20 volymprocent, 50 ng/ml human epidermal tillväxtfaktor, 10 mM nikotinamid, 10 nM [Leu15]-Gastrin I, 500 nM A-83-01, 10 μM SB202190, 1x B27-tillskott, 1x N2-tillskott och 1 mM N-acetylcystein.
2. För lentiviral transduktion, förbered Fetal Bovine Serum (FBS), 0,05 % trypsin-EDTA i 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), CMGF- med 10 % FBS, steril 1x PBS, polybrene, 10 μM Y-27632, Lentivirus, High Wnt WRNE + 10 μM Y-27632
3. För att generera organoidmonolager, förbered glasbotten 10-brunns cellodlingsglas, FBS, kollagen IV (1 mg/ml i avjoniserad (di)H₂O), basalmembranmatris, 0.5 mM EDTA i 1x PBS, 5 mM EDTA i 1x PBS, enzymatisk dissociationsbuffert, CMGF- med 10 % FBS, WRNE + 10 μM Y-27632.
4. För virusinfektion av organoida monolager, förbered trypsin, rotaviruslager, CMGF-, 25G-nål, steril 1x PBS och fenolrödfria differentieringsmedier.
   1. För att bereda fenol-rödfria differentieringsmedier, ta 500 ml fenol-rödfria cellodlingsmedier, tillsätt 5 ml 100 x MEM icke-essentiella aminosyror, 5 ml 100x L-glutamin, 5 ml 100 nM natriumpyruvat och 7,5 ml 1 M HEPES.
5. För immunofluorescensfärgning av organoider, förbered 4 % formaldehyd (16 % formaldehyd utspädd i 1x PBS), Triton X-100 (0,1 % Triton X-100 i 1x PBS), bovint serumalbumin (3 % bovint serumalbumin i 1x PBS), NH₄Cl-lösning (50 mM), DAPI (1 μg/ml DAPI-lösning i 1x PBS).

2. Konstruera organoider för att uttrycka genetiskt kodade kalciumsensorer

OBS: Detta protokoll beskriver stegen för att transducera en enda brunn med 3-dimensionella mänskliga tarmorganoider pläterade i 30 μL Basement Membrane Matrix (BMM) på en 24-brunnars platta¹³. De flesta linjer innehåller cirka 400 000 celler per brunn. En andra, icke-transducerad brunn bör inkluderas som kontroll. Förvara alla reagenser och cellsuspensioner på is.

1. Efter 2-5 dagar från den sista passagen, ta bort underhålls-WRNE-medium från två brunnar med HIO. Ersätt med 300 μL 0,05 % trypsin-EDTA per brunn och pipettera försiktigt upp och ner 5 gånger för att lossa BMM från plattan. Placera i en inkubator vid 37 °C i 4 minuter.
2. Tillsätt 500 μL CMGF- + 10 % FBS per brunn. Förbestryk en 1 ml lågbindande pipettspets med FBS genom att pipettera 1 ml FBS upp och ner 2x. FBS kan återanvändas på flera spetsar. Med den förbelagda spetsen pipetterar du HIO:erna upp och ner 10 gånger.
3. Överför innehållet i varje brunn till sitt eget förbelagda 1.5 ml mikrocentrifugrör. Skölj varje väl med ytterligare 500 μL CMGF- och tillsätt tvätten i respektive rör.
4. Centrifugera rören vid 100 x g i en centrifug med svängande skopa i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och eventuella kvarvarande BMM.
5. Återsuspendera i 1 ml 1x PBS. Dela upp varje rör i två mikrocentrifugrör för totalt 4 rör. Centrifugera rören vid 100 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatant.
6. Blanda om varje rör ytterligare en gång i 1 x PBS och centrifugera vid 100 x g i 5 minuter vid 4 °C.
7. Bered 400 μl transduktionsmedium och kontrollmedium (tabell 1). Återsuspendera 2 rör i 200 μl av kontrollmediet och 2 rör i 200 μl av transduktionsmediet.
8. Inkubera i en 37 °C cellodlingsinkubator i 24 timmar. Återsuspendera genom att pipettera upp och ner med en belagd spets med jämna mellanrum (t.ex. 2 timmar efter transduktion (hpt), 12 hpt, 18 hpt) för att uppmuntra enhetlig transduktion.
9. Efter 24 timmar centrifugeras rören vid 100 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatant.
10. Återsuspendera pellet i 500 μL 1x PBS för att tvätta. Centrifugera vid 100 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatant.
11. Använd en iskall 200 μL pipettspets och återsuspendera var och en av de 4 pelletsen i 30 μL BMM. Pipettera försiktigt upp och ner för att fördela jämnt.
12. Plätera innehållet i varje rör i sin egen brunn på en platta med 24 brunnar. Inkubera i 10 minuter vid 37 °C så att BMM kan stelna innan 500 μl HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632 tillsätts.
13. Låt transducerade HIO:er växa i 1 vecka, uppdatera mediet (HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632) varannan dag. Efter 1 vecka, kontrollera uttrycket av den fluorescerande indikatorn med mikroskopi. Om signalen är stark, börja med val av läkemedel. Om signalen är svag, upprepa transduktionen enligt beskrivningen ovan.
14. När linjen har etablerats, kontrollera fluorescensindikatorns funktion via agonistbehandling. 100nM ADP är en pålitlig agonist för GCaMP-validering. Testa 3D-organoider för initial validering enligt beskrivningen nedan.
    1. Efter en passage plattas en brunn (eller flera) av organoider i BMM på en separat bottenplatta för avbildning. Platta organoiderna vid cirka 1/3 av den normala densiteten för att undvika överskottsöverlappning vid avbildning. Fortsätt inte att passera dessa HIOs efter agonistbehandling, eftersom det är svårt att säkerställa sterilitet.
    2. Vänta 2-3 dagar för HIO:erna att återhämta sig efter passagen. Före avbildning, byt ut mediet till fenol-rödfritt differentieringsmedium.
    3. Använd ett fluorescerande mikroskop och ställ in en 3 minuters körning med bilder tagna var 5:e sekund med 488 nm excitation och en FITC/GFP-filteruppsättning. Efter 30 sekunders bildtagning tillsätts 100 nM ADP eller fordonskontroll. Fortsätt avbildningen tills signalen återgår till nära baslinjen, ~2 min. En övergående, ~2-faldig ökning av GCaMP-fluorescens med ADP-behandling indikerar framgångsrik transduktion och biosensorfunktion. För en mer exakt uppskattning av transduktionseffektiviteten, upprepa agonisttestet med avbildning med monolager som genererats via den process som beskrivs i del 3.

3. Beredning av HIO-monolager för fluorescensavbildning i realtid

1. Täck alla brunnar i en 10-brunnars avbildning av bottenkammarglas med kollagen IV. För att göra detta, blanda 34 μL 1 mg/ml Collagen IV med 960 μL sterilt avjoniserat vatten. Tillsätt 95 μl utspätt kollagen IV-lösning till varje brunn och inkubera vid 37 °C i 0,5–2 timmar.
2. Ta bort WRNE-underhållsmediet från 4 brunnar med 3D HIO:er. HIO:er bör vara 5-7 dagar från den senaste passagen.
   OBS: 1 10-brunnars platta kräver vanligtvis ~1.25 x 10⁶ celler. Detta kräver vanligtvis 2-4 brunnar med 3D HIO:er pläterade i 30 μL BMM vardera, men kommer att variera beroende på densitet.
3. Tillsätt 500 μL 1x PBS + 0,5 mM EDTA per brunn. Med en förbelagd 1 ml spets, pipettera försiktigt upp och ner för att lossa BMM från plattan. Överför suspensionen till ett förbelagt 15 ml koniskt rör, kombinera som brunnar i samma rör.
4. Skölj varje väl med ytterligare 500 μL PBS + 0.5 mM EDTA. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och kvarvarande BMM.
5. Använd en förbelagd spets och återsuspendera den återstående pelleten i 3 ml PBS + 5 mM EDTA (observera att detta är 10 gånger mer EDTA än den första tvätten).
6. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och kvarvarande BMM. Återsuspendera pelleten i 2 ml enzymatisk dissociationsbuffert.
7. Inkubera i 37 °C pärla/vattenbad i 5 min. Tillsätt 3 ml CMGF- + 10 % FBS och pipettera försiktigt för att blanda.
8. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten. Tillsätt 1 ml CMGF-.
9. Pipettera kraftigt upp och ner med en förbelagd spets 80x-100x för att mekaniskt bryta ner HIO:er i enstaka celler. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatant.
10. Återsuspendera i 1 ml WRNE + 10 μM Y-27632. Erhåll ett celltal för 1 ml suspension.
11. Späd cellsuspensionen med WRNE + 10μM Y-27632 för att uppnå en koncentration på 1,25 x 10⁵ celler/100 μL (1,25 x 10⁶ celler/ml).
12. Använd en 200 μL pipett och ta bort kollagenlösningen från plattan som beretts i steg 1, eftersom kollagenet nu har lagt sig på botten av brunnen. Undvik att vidröra brunnens botten med pipettspetsen.
13. Använd en förbelagd 200 μL pipettspets och tillsätt 100 μL av celllösningen från steg 3.11 (1.25 x 10⁵ celler) per brunn.
14. Inkubera i 24 timmar i en 37 °C cellodlingsinkubator. Efter 24 timmar avlägsnas odlingsmediet från alla brunnar och ersätts med 100 μl differentieringsmedium per brunn.
    OBS: Vid det här laget bör cellerna fästa vid plattan. Observera att monolagret sannolikt inte kommer att vara sammanflytande eller helt plant.
15. Sätt tillbaka objektglaset i 37 °C cellodlingsinkubatorn. Uppdatera differentieringsmediet var 24:e timme tills monolagret är sammanflytande. Detta kräver vanligtvis 3-5 dagar från plätering. Efter denna punkt är monolagren redo för nedströmsapplikationer.

4. Virusinfektion av HIO-monolager

1. Förbered virusinokulatet. Vid behov aktiverar trypsin viruslagret. För rotavirus, tillsätt 10 μg/ml Worthingtons trypsin till viruslagren och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
   1. Späd ut det aktiverade viruslagret med en av följande två metoder.
      1. Om du siktar på maximalt antal infekterade celler med endast en virusstam, blanda 50 μL av den aktiverade virusstammen med 50 μL CMGF-.
      2. Om du jämför flera stammar, förbered inokulumen för att uppnå likvärdiga infektionsmultipliciteter (MOI). Använd följande formel för att bestämma volymen viruslager per brunn som krävs för önskad MOI. Tillsätt CMGF- till den viruslagervolym som beräknats för att uppnå en slutlig volym på 100 μl per brunn.
         
         OBS: Ett enda HIO-monolager pläterat i en brunn med en diameter på 5,46 mm (96-hålsplatta) innehåller cirka 200 000 celler. På grund av den dåliga effektiviteten av infektion i monolager är ett högt MOI (100-1 miljon viruspartiklar per cell) att föredra. Den optimala MOI måste bestämmas empiriskt.
   2. Infektera monolagren genom att försiktigt ta bort mediet från HIO-monolagret med en 200 ml pipett. Ersätt med 100 ml virusinokulum eller låtsasinokulum.
      1. Eftersom de flesta rotavirusstammar förökas i MA104-celler, använd ett oinfekterat MA104-celllysat för det falska inokulatet. Använd en volym som motsvarar den volym viruslager som används för de infekterade brunnarna och tillsätt CMGF- för en slutlig volym på 100 ml per brunn.
      2. För virus som infekterar celler basolateralt, såsom rotavirus¹⁴, använd en 25G-nål för att skåra monolagret. Det är lättast att göra en enda skåra över monolagrets längd, från botten till toppen av brunnen. Tryck försiktigt in nålen i monolagret i en vinkel med fassidan uppåt, motsatt rörelseriktningen, och dra den över monolagrets längd för att skapa ett ärr (Figur 2A).
   3. Inkubera i en inkubator vid 37 °C i 2 timmar. Ta bort viruset och låtsasinokulat. Tvätta enskikten en gång med 1x PBS.
   4. Tillsätt 100 μl fenol-rödfritt differentieringsmedium. Placera objektglaset i en inkubator för 37 °C tills du är redo att ta bilden. Det optimala avbildningsfönstret varierar beroende på virusinfektionens kinetik. För rotavirus, påbörja avbildning 6-8 timmar efter infektion.

5. Ca²⁺ Avbildning av infekterade monolager

1. Förvärm sceninkubatorn till 37 °C. Kör befuktad CO₂ vid 0.02 L/min. Placera objektglaset med de infekterade monolagren i inkubatorkammaren och försegla locket.
2. Använd ljusfältsbelysning (BF) och ett 20x-objektiv och välj X- och Y-koordinaterna för synfälten i monolagret som ska avbildas. Det är bäst att välja punkter med den poängsatta regionen i sikte, eftersom de flesta infekterade celler kommer att vara nära skrapan.
3. Optimera bildparametrar och ta en bild med 488 nm excitation. För att minimera fototoxicitet, ställ in ljuskällan på 50 % effekt med en exponeringstid på 50 ms. Lämpliga förvärvsparametrar kan variera och bör optimeras genom att förvärva flera förvärv. Se till att inga pixlar är mättade. Justera exponeringstid och ljuseffekt efter behov för att säkerställa att hela det dynamiska omfånget för den fluorescerande kalciumsensorn kan detekteras.
4. Om du använder andra fluoroforer (t.ex. fluorescerande märkta virus), upprepa optimeringen på dessa kanaler. Ställ in bildslingan och ta en 488 nm-bild vid varje vald X, Y-koordinat i en 1 min slinga. Föreställ dig den här loopen kontinuerligt. När du använder ett fluorescerande taggat virus, hämta en bild på lämplig kanal var 10^:e slinga (dvs. 1 bild/10 min).
5. Samla bilder i ~18 timmar. Om du använder virus utan fluorescerande taggar, fixera monolager och utför immunofluorescensfärgning för att identifiera infekterade celler. Utför detta när du har slutfört avbildningskörningen enligt beskrivningen nedan.
   1. Ta bort bildmaterialet och ersätt det med 100 μL 4 % formaldehyd i 1x PBS. Inkubera i rumstemperatur i 30 min.
   2. Ta bort fixeringsmedlet och släck med 100 μL 50mM NH₄Cl i 10 min. Ta bort NH₄Cl. Permeabilisera monolagren med 100 μL 0,1 % Triton X-100 i 1x PBS i 1 timme i rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
   3. Ta bort permeabiliseringsbufferten. Blockera med 100 μl 3 % bovint serumalbumin i 1x PBS i 1 timme.
   4. Ta bort den blockerande lösningen. Tillsätt primära antikroppar utspädda till den rekommenderade/optimerade koncentrationen i 1x PBS. Tillsätt 100 μl antikroppslösning per brunn.
   5. Inkubera över natten vid 4 °C med lätt gungning. Ta bort primära antikroppar. Tvätta 3x med 1x PBS.
   6. Tillsätt fluorescerande konjugerade sekundära antikroppar utspädda till den rekommenderade/optimerade koncentrationen i 1x PBS. Tillsätt 100 μL per brunn. Inkubera i 2 timmar i rumstemperatur.
      OBS: FPBase¹⁵ är en bra resurs för att hjälpa till att välja sekundärer som undviker genomblödning vid multiplexering. De flesta sekundärer är effektiva vid en utspädning på 1:1000 i 1x PBS.
   7. Ta bort sekundära antikroppar. Gör en 1 μg/ml DAPI-lösning i 1x PBS och tillsätt 100 μL per brunn. Inkubera i 20 min. Ta bort DAPI. Tvätta 3x med 1x PBS.
   8. Förvara fasta monolager i 100 μL 1x PBS för avbildning. Placera tillbaka objektglaset på mikroskopetage, ladda om X- och Y-koordinaterna från live-avbildningskörningen och avbilda varje multipunkt på kanalen som motsvarar den sekundära antikroppen som användes för färgning. Referera till bilderna från liveavbildningskörningen för att säkerställa att samma punkter avbildas.

6. Kvantifiering av intercellulära kalciumvågor

1. Se till att Fiji is Just ImageJ (FIJI) är installerat med följande plugin-program: Bio-Formats (bör vara förinstallerat i FIJI men kommer inte att finnas i ImageJ); Kokbok: Om du vill installera går du till Hjälp > uppdateringar > hanterar uppdateringswebbplatser från FIJI-menyn. Kolla kokboken. Starta om FIJI.
2. Dela upp datafilen från liveavbildningskörningen i flera filer, separera varje X- och Y-koordinat. I Nikon NES Elements väljer du Arkiv > Importera/exportera > Dela Multipoints. Välj en mapp för export och ett lämpligt prefix.
3. Öppna FIJI. Ladda en enda fil från de delade multipunkterna. Om du använder en flerkanalsbild delar du kanalerna. Välj fönstret med bilderna från 488 nm-kanalen (GCaMP).
4. Kör funktionen DeltaF Up för att fastställa ändringen i varje pixelvärde från en tidpunkt till nästa. Det gör du genom att välja Kokbok > T-funktioner > Delta F Up.
5. Bläddra igenom stapeln tills en bild med en kalciumvåg hittas. Med kalciumvågen i sikte ställer du in ett tröskelvärde genom att klicka på Bild > Justera > tröskel. Justera den nedre gränsen för att minimera mängden signal som inte är en del av vågen som gör att den passerar tröskeln. För 16-bitarsbilder som tagits med de parametrar som beskrivs ovan börjar du med ett lägre tröskelvärde på 600 och justerar efter behov.
6. Kör partikelanalysatorn för att segmentera vågor genom att klicka på Analysera > Analysera partiklar. Ställ in den minsta storleken på vågen i μm² genom att justera intervallet. Den är inställd på 0-oändlighet vid baslinjen. För bilder av MA104-celler tagna med ett 20x-objektiv, börja med att öka den nedre gränsen till 10 000^μm2 och justera efter behov.
7. Markera rutorna för Visa resultat och Rensa resultat. I rullgardinsmenyn "Visa" väljer du Konturer och klickar sedan på OK. Detta bör resultera i 2 utgångar: Ett fönster, Resultat, listar varje upptäckt våg, vågens area och dess medelvärde, lägsta och högsta intensitetsvärden (baserat på delta F). Det andra fönstret, med titeln Ritning av [filnamn], kommer att innehålla en ny stapel med konturerna av segmenterade vågor. Använd detta för att verifiera vågidentifiering. Justera tröskelvärden och storleksintervall om det behövs och kontrollera vågsamtalen igen.
8. För batchbearbetning, använd det makroskript som ingår (Kompletterande kodningsfil 1). För att använda detta, följ stegen som beskrivs nedan.
   1. Dela upp flera punkter i enskilda filer enligt beskrivningen i steg 6.2. Öppna FIJI. Välj Bearbeta > Batch > makro. I rutan "indata" anger du kartan till mappen som innehåller de delade flerpunktsfilerna. Lämna rutan "output" tom.
   2. Klistra in skriptet från Supplementary Coding File 1 i rutan. Justera tröskelvärdet för intensitet och storlek i skriptet så att de återspeglar de optimerade parametrarna från steg 6.5 och 6.6.
   3. Klicka på Process. Beroende på antalet multipunkter och datorns bearbetningshastighet kan det ta 30 minuter eller längre att bearbeta alla bilder. När det är klart kommer data att skrivas in i en ny kalkylbladsfil med namnet "Byt namn på mig efter att ha skrivit" på skrivbordet. Utdatafilen ska för varje multipunkt innehålla ett vågantal och vågmått (area, medelintensitet, lägsta och högsta intensitet och intensitetstäthet).

Figur 1A visar en BMM-kupol som innehåller 3-dimensionella mänskliga tarmorganoider som har transducerats för att stabilt uttrycka GCaMP6s. Figur 1B visar samma linje av organoid ompläterad som ett monolager vid 24, 48 och 72 timmar efter sådd. För att validera funktionen hos GCaMP6s avbildades monolagret med fluorescensmikroskopi varannan sekund i 4 minuter, och 100 nM ADP tillsattes till mediet efter ~20 s. ADP framkallar kalciumfrisättning från det endoplasmatiska nätverket, vilket ökar cytosoliskt kalcium. Fluorescensintensiteten som detekteras på 488 nm-kanalen vid varje exponering plottas i figur 1C. Spåret visar en stadig fluorescensintensitet vid baslinjen följt av en snabb ökning vid ADP-tillsats och en gradvis återgång till baslinjen. En fordonskontroll ingår för att verifiera att svaret är en verklig signalhändelse, och inte bara en förändring i fluorescensintensiteten som kan uppstå genom tillsats av media.

Att poängsätta ett HIO-monolager ökar effektiviteten av rotavirusinfektion. Även om teknikerna för poängsättning varierar, är det lättast att få konsekvent infektion med en enda poäng längs monolagrets längd, som visas i figur 2A. Vid användning av rekombinanta stammar av rotavirus som uttrycker fluorescerande proteiner kan infektionen verifieras under live-avbildning (Figur 2B). Vid användning av en stam som inte uttrycker en markör kan infektion upptäckas genom immunofluorescens efter avbildning. Med tanke på cellernas rörlighet i HIO-monolager är det ofta svårt att spåra en enda infekterad cell över tid. Använd i stället slutpunktsfärgning som en metod för att verifiera infektion och bekräfta att infektionsmultipliciteten matchas mellan synfälten (Figur 2C).

Intercellulära kalciumvågor i HIO kan observeras kvalitativt, vilket visas i figur 3A. Att bestämma frekvensen av kalciumvågor i ett givet synfält kräver dock kvantitativ analys. Stegen för framgångsrik segmentering, som beskrivs i steg 6 i protokollet ovan, illustreras i figur 3A. Figuren visar den råa bilden (figur 3Ai), bilden efter att pixelintensiteterna från föregående bildruta har subtraherats (figur 3Aii), sedan den segmenterade kalciumvågen (figur 3Aiii).

När kalciumvågorna har segmenterats och kvantifierats för varje synfält under bildkörningen är det ofta informativt att jämföra frekvensen av vågor i monolager som utsätts för olika förhållanden. Remsdiagrammet i figur 3B visar det totala antalet kalciumvågor per synfält i simulerade och rotavirusinokulerade monolager. Detta exempel inkluderar två stammar av RV: en stam av humant rotavirus (Ito HRV) och en rekombinant stam av simian rotavirus SA11 som uttrycker mRuby (SA11-mRuby). Den skeninfekterade kontrollen tas som baslinjekalciumvågsfrekvensen, de obehandlade rotavirusinfekterade monolagren fungerar som positiva kontroller, och de rotavirusinfekterade, behandlade monolagren är de experimentella förhållandena. Skeninfekterade och RV-infekterade monolager som behandlats med läkemedel, inklusive ADP-receptorhämmaren, BPTU, kan sedan jämföras med båda kontrollbetingelserna med envägs ANOVA. Data tyder på att BPTU effektivt minskar frekvensen av intercellulära kalciumvågor.

Figur 1: Validering av GCaMP6s-uttryck i jejunala mänskliga tarmorganoider. (A) Efter lentivirustransduktion genomgick de GCaMP-uttryckande HIO:erna selektion och multipla passager, som här visas 7 dagar efter den senaste passagen. Vid stimulering med 488 nm-lasern är GCaMP6s-uttrycket tydligt i de transducerade HIO:erna pläterade i 15 μL basalmembranmatris som 3-dimensionella sfäroider (Ai). 50 ms exponeringar samlades in med 50 % lasereffekt med hjälp av ett 20x-objektiv och sammanfogades sedan för att visualisera hela basalmembranets matriskupol. En liknande process utfördes med 4 ms ljusfältsexponeringar (Aii). I ljusfältsbilden är de mörka HIO:erna i mitten av kupolen en indikation på att kulturerna är redo för passage. (B) HIO:er rötades enzymatiskt till en encellssuspension och ompläterades sedan med en densitet av 150 000 celler per brunn (5 mm i diameter) av en bottenplatta för avbildning som var förbelagd med kollagen IV. 72 timmar efter sådd var monolagret sammanflytande och redo för nedströmsapplikationer. För att validera GCaMP:s funktion togs bilder med hjälp av 488 nm-filtersetet med 50 ms exponeringar vid 50 % lasereffekt varannan sekund i 4 minuter. (C) Spåren som visas här representerar helfältsfluorescensintensiteten normaliserad till den första bilden under avbildningen. Omkring 20 sekunder (pil), efter den tionde exponeringen, tillsattes 100 nM adenosindifosfat (ADP) för att framkalla en ökning av cytosoliskt kalcium (rött). Tillsatsen av en lika stor volym av 1x PBS framkallade inte ett meningsfullt svar (blått). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Poängsättning av ett HIO-monolager för att underlätta RV-infektion. (A) Figuren illustrerar en lämplig teknik för att skära ett enskikt med hjälp av en 25G-nål. (B) Ett HIO-monolager infekterades med en rekombinant stam av RV som uttrycker det fluorescerande proteinet mRuby (magenta, pil), vilket gör det möjligt att identifiera infekterade celler. Alternativt, när man använder en naturligt förekommande stam av RV, kan infekterade celler identifieras med hjälp av immunofluorescens. (C) Bilderna som visas är från 4 olika HIO-monolager efter fixering, DAPI-färgning (blå) och antikroppsmärkning av rotavirusantigen (magenta). Båda teknikerna illustrerar den föredragna RV-infektionen nära den poängsatta delen av monolagret. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Segmentering och kvantifiering av RV-inducerade intercellulära kalciumvågor. De 488 nm-exponeringarna av RV-infekterade HIO:er som uttrycker GCaMP6 registrerades var 1:e minut i 16 timmar med hjälp av protokollet. (A) Figuren illustrerar processen för intercellulär kalciumvågssegmentering. Först subtraheras pixelvärdena från den tidigare bilden (_t-1) från varje råbild (Ai) för att kvantifiera förändringen i fluorescensintensitet (Aii). Ett tröskelvärde baserat på en experimentellt optimerad minsta ökning av intensiteten från föregående bildruta tillämpas sedan. Bilderna filtreras sedan för ett minsta sammanhängande signalområde för att välja för intercellulära kalciumvågor (Aiii) och utesluta encelliga kalciumsignaler. Denna bearbetning möjliggör kvantifiering av kalciumvågor i varje synfält. I detta experiment var monolager antingen skeninfekterade, infekterade med ITO-stammen av humant rotavirus (HRV), eller infekterade med en rekombinant stam av simian rotavirus som kodar för mRuby på gensegment 7, nedströms icke-strukturellt protein 3 (SA11-mRuby). Infekterade monolager behandlades antingen med ADP-receptorhämmaren BPTU eller lämnades obehandlade. Monolager avbildades sedan vid 8 olika positioner, och kalciumvågor i varje synfält kvantifierades med hjälp av pipelinen som beskrivs i detta protokoll. Punkterna i remsdiagrammet anger antalet kalciumvågor som detekteras vid varje position överlagrat på ett stapeldiagram som markerar medelvärdet och SD. Envägs ANOVA följt av Dunnetts tester visar att medan endera stammen av RV ökar frekvensen av intercellulära kalciumvågor över den hos den oinfekterade gruppen, förhindrar BPTU-behandling den RV-medierade ökningen av kalciumvågfrekvensen. **p<0,01, ***p<0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Medium för transduktion av lentivirus. Bered transduktionsmediet och kontrollmediet genom att kombinera reagenserna i de volymer som anges i den andra respektive tredje kolumnen. Sikta på en multiplicitet av infektioner (MOI) på 10 lentivirustransduktionsenheter per cell. För egenförpackad LV kräver detta vanligtvis ~25-50 μL koncentrerad LV. Titern för de flesta kommersiellt förpackade LV kommer att förses med analyscertifikatet.

Kompletterande kodningsfil 1: ImageJ makroskript för att möjliggöra kvantifiering av kalciumvågor genom batchbearbetning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Förändringar i cytosoliska Ca²⁺ nivåer kan vara både en orsak och effekt av patologier inom epitelet 10,16,17. Ökningar av cytosoliskt kalcium kan direkt driva sekretion via aktivering av den kalciumberoende kloridkanalen TMEM16A^18,19. Aktivering av TMEM16A som svar på Ca²⁺ möjliggör apikalt utflöde av klorid, vilket skapar en osmotisk gradient som främjar vätskeutsöndring^20,21. Dessutom utlöser ökningar av Ca²⁺ i enteroendokrina celler frisättningen av serotonin, som stimulerar afferenta sensoriska neuroner som kan modulera aktiviteten i det enteriska nervsystemet²². Ca²⁺-signaler kan också modulera tight junctions för att påverka barriärfunktionen^23,24 och reglera proliferation i tarmstamceller²⁵. Dysreglering av Ca²⁺ kan alltså ha breda och långtgående effekter.

Många virus manipulerar cytosoliskt Ca²⁺ för att skapa en cellulär miljö som främjar replikation²⁶. Rotavirus är ett utmärkt exempel på detta i tarmepitelet²⁷. Icke-strukturellt rotavirusprotein 4 (NSP4) är en Ca²⁺-ledande kanal som möjliggör utflöde av Ca²⁺ från det endoplasmatiska nätverket till cytosolen^28,29. Detta stimulerar autofagi och underlättar monteringen av den yttre kapsiden 30,31,32. Rotavirusinfektion inducerar också frisättning av ADP, vilket utlöser intercellulära Ca²⁺-vågor som bidrar till patogenes¹⁷. Andra enteriska virus, inklusive både calicivirus och enterovirus, kodar för Ca²⁺-ledande viroporiner som utlöser liknande dysreglering av Ca²⁺ i infekterade celler^33,34.

Levande cell Ca²⁺ -avbildning av humana tarmorganoider erbjuder en mångsidig plattform för att studera virusinducerad signalering i epitelet. Styrkan i de slutsatser som dras från bilddata beror dock oupplösligt nog på HIO:ernas hälsa och kvalitet, lämpliga avbildningsparametrar och ett sunt analytiskt tillvägagångssätt.

Effektiv lentiviral transduktion är ofta det begränsande steget vid etablering av nya HIO-linjer, men lentivirus med hög titer och multipla transduktioner hjälper till att säkerställa tillräckligt transgenuttryck. Det är viktigt att detta balanseras med risken för betydande cellulär stress vid transduktion. Detta är oftast tillfälligt och avtar efter urval och flera passager. Icke desto mindre är det viktigt att HIO:er som är konstruerade för att uttrycka GECI:er uppvisar normal tillväxt och spridning innan experiment påbörjas. På samma sätt inducerar spridning av 3-dimensionella HIO:er och reformering av dem som monolager cellulär stress. Det är bästa praxis att tillåta tre eller fler dagar för monolager att anpassa sig efter plätering. Att belägga plattorna med kollagen IV är avgörande för monolagerintegriteten ^35,36. Alikvotering av kollagen IV och förvaring vid -80 °C mellan användningarna hjälper till att säkerställa vidhäftning av ett lager. Att bestämma den optimala såddtätheten för varje HIO-linje kan också bidra till att förbättra konsistensen. Slutligen är det nödvändigt att inkludera lämpliga kontroller och jämföra dem mellan experiment för att säkerställa att varje observation representerar ett svar på variabeln i fråga, snarare än en teknisk störa.

Även om poängsättning av ett monolager kan orsaka oönskad cellskada, förbättrar det avsevärt RV-infektion av 2D HIO:er. Figur 2 illustrerar detta, eftersom nästan alla infekterade celler finns i direkt anslutning till repan. Experimentella bevis tyder på att RV infekterar mest effektivt på den basolaterala ytan av tarmepitelceller³⁷. Således förutspås det att poängsättning av ett monolager ökar infektionsförmågan genom att exponera den basolaterala ytan. Effektiv infektion i ett lager kan också uppnås genom plätering av HIO:er på polykarbonatmembran upphängda i brunnar som innehåller odlingsmedium, vilket ger tillgång till den basolaterala ytan. Det relativt långa avståndet mellan plattan och polykarbonatmembranet, själva polykarbonatmembranet och plastytan vid brunnens botten gör dem dock olämpliga för epifluorescensavbildning. Poängsättningsmetoden som beskrivs i detta protokoll är därför fortfarande den föredragna metoden. Med tanke på att poängsättningen i sig kan leda till signalerande störningar är det viktigt att inkludera den oinfekterade, poängsatta kontrollen för tolkningen. För virus, såsom humant norovirus, som effektivt infekterar via det apikala membranet, krävs inte poängsättning av monolagret³⁸.

Som med alla live-avbildningssystem kan fototoxicitet lätt förvirra experiment som använder HIO-monolager. Under ett avbildningsexperiment är det viktigt att övervaka för oväntad vakuolisering, membranblödning eller andra morfologiska indikatorer på stress³⁹. Om något av dessa tecken upptäcks måste varaktigheten, frekvensen eller effekten av excitation minskas. Att öka signal-brusförhållandet sker ofta på bekostnad av den långsiktiga cellhälsan, därför är empiriskt optimerande parametrar avgörande. Fotoblekning, som indikeras av en minskning av den ursprungliga fluorescensintensiteten över tid, är ett förebud om cellstress och bör undvikas.

Visualiseringen av bilddata kan leda till att utredare föredrar kvalitativa, snarare än kvantitativa, analyser. Men som med alla modaliteter kräver reproducerbara slutsatser kvantifiering. Kvantitativ bildanalys innehåller mycket mer komplexitet än vad som kan täckas i ett enda manuskript, men det är värt att lyfta fram några viktiga punkter. För det första kräver konsekvent kvantifiering konsekvent förvärv. En analyspipeline som utvecklats för en given uppsättning insamlingsparametrar kanske inte är effektiv för bilder som tagits vid olika frekvenser, exponeringstider, laserstyrkor eller våglängder. För det andra har infektionsmångfalden en stor inverkan på frekvensen av virusinducerade kalciumsignaler. Därför är det viktigt att utvärdera antalet infekterade celler per synfält och säkerställa att behandlingsförhållandena är konsekventa. Alternativt kan normalisering av signalfrekvensen till antalet infekterade celler per synfält hjälpa till att minska felen. Slutligen, medan den nyligen utvecklade mNG-baserade kalciumindikatorn (NEMO) erbjuder ett lovande tillvägagångssätt för att bestämma absoluta Ca²⁺ -koncentrationer i celler⁴⁰, förmedlar de flesta biosensorer endast relativ information om biologiska system. Därför är bakgrundssubtraktion, normalisering och jämförelse med en kontroll avgörande.

Även om detta protokoll fokuserar på kalciumavbildning under virusinfektion, är det allmänna tillvägagångssättet lätt att anpassa. Virusinfektion kan lätt ersättas med ett alternativt behandlingstillstånd, och det finns en ständigt växande litania av biosensorer för att övervaka många olika cellulära vägar och processer. Med alla protokollanpassningar måste utredarna hålla analysen i åtanke och utforma experiment med tydliga, kvantifierbara resultat.

Sammantaget ger live-avbildning oöverträffad tidsupplösning, vilket förbättrar karakteriseringen av mycket dynamiska processer. Att inkorporera organoider i levande avbildningsexperiment gör det möjligt att observera dessa processer i en verklighetstrogen fysiologiskt relevant modell. Vi hoppas att protokollet som beskrivs här underlättar experimentell design och optimering, vilket ger forskare möjlighet att upptäcka nya aspekter av cell- och vävnadssignalering.