"Hjernemalkning" -metoden til isolering af neurale stamceller og oligodendrocytstamceller fra levende rotter

Vævsspecifikke stamceller er delvist forpligtede celler, der kan give anledning til alle cellepopulationer, der udgør de respektive væv. Bortset fra at være multipotente, er de selvfornyende celler og afgørende for at opretholde homøostase og regenerativ kapacitet af væv¹. Nogle vævsspecifikke stamceller forbliver i en aktiv, stærkt proliferativ tilstand, såsom tarm- eller hæmatopoietiske stamceller. Andre, såsom hjernestamceller, forbliver stort set hvilende eller sovende². I den voksne hjerne kan neurale stamceller (NSC'er) findes i specialiserede områder, ofte kaldet nicher. To sådanne velbeskrevne områder findes i den subependymale zone (SEZ) i de laterale ventrikler og i dentate gyrus i hippocampus. SEZ-nichen genererer det højeste antal celler, primært neuroblaster, der migrerer mod de olfaktoriske pærer og bidrager til den lokale interneuronpopulation; i modsætning hertil migrerer genererede oligodendroblaster til det tilstødende corpus callosum (CC)³. Oligodendrocytstamceller (OPC'er) er mitotisk aktive celler, bredt fordelt i hele centralnervesystemet, som: i) er forpligtet til oligodendroglial afstamning, ii) kan migrere til demyeliniseringssteder og iii) kan differentiere sig til myeliniserende oligodendrocytter. OPC'er udviser også selvfornyelsespotentiale og stilstand⁴.

Indtil nu har isolering og undersøgelse af NSC'er og OPC'er krævet postmortem dissociation af den dissekerede hjerne og rygmarvsvæv. For at omgå denne eksperimentelle begrænsning etablerede vi en metode, der for første gang tillader isolering af hjerne-NSC'er og OPC'er fra levende dyr. Vi kalder denne metode "malkning", fordi den muliggør flere samlinger af celler, da deres puljer ikke er udtømt. Protokollen blev udviklet hos rotter på grund af deres store hjernestørrelse, der hovedsageligt er rettet mod SEZ eller CC, og omfatter to hovedtrin. For det første "fjernes" NSC'er eller OPC'er fra vævet via icv-injektion af en "frigivelsescocktail" indeholdende neuraminidase, et toksin, der inducerer ventrikulær vægdenudation, et integrin-β1-blokerende antistof og fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2). Cocktailen injiceres stereotaksisk bilateralt i laterale ventrikler. Hvis den tilsigtede anvendelse er isolering af NSC'er, er rostrale områder af laterale ventrikler målrettet. Hvis målet er at isolere OPC'er mere rent, injiceres cocktailen kausalt i området med hippocampal fimbria. Ved et andet "indsamlingstrin" udføres flydende biopsier af cerebrospinalvæske (CSF) fra cisterna magna af bedøvede rotter uden behov for et snit. Den flydende biopsi blandes med NSC-dyrkningsmedium og kan opbevares ved 4 °C indtil plettering.

Dyreavl, vedligeholdelse og forsøgsprocedurer blev udført i overensstemmelse med UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, godkendt af indenrigsministeriet, og med præsidentdekret 56/2013 fra Den Hellenske Republik, undersøgt af dyrevelfærds- og etiske undersøgelsesorganer ved universiteterne i Cambridge og Patras samt godkendt og undersøgt af den lokale præfekturkomité for dyrepleje og brug (protokolnummer: 5675/39/18-01-2021). Han- og hunrotter af Sprague-Dawley, Wistar og Long-Evans med aldre varierende mellem 2 og 4 måneder og med kropsvægt mellem 150 g og 250 g blev anvendt. Protokollen er grafisk opsummeret i figur 1.

1. Frigør cocktailforberedelse

BEMÆRK: Forbered frisk på dagen for proceduren og hold på is. Mængderne angives pr. 2 μL, der skal injiceres i hver lateral ventrikel. Forbered yderligere 1 μl pr. tilsigtet injektion.

1. Forbered 0,5 μL 500 mU neuraminidase fra Clostridium perfringens , (Clostridium welchii).
   BEMÆRK: Opbevar dette som en 1 E/μL stam fortyndet i sterilt vand ved -20 °C. Andre typer neuraminidaser er ikke blevet testet.
2. Forbered 1 μL indeholdende 1 μg integrin-β1-blokerende antistof.
   BEMÆRK: Opbevar den ved 4 °C.
3. Forbered 0,5 μL indeholdende 0,5 μg basisk fibroblastvækstfaktor (rekombinant human FGF-basisk).
   BEMÆRK: Opbevar den som en 1 μg/μl stam fortyndet i sterilt vand ved -20 °C.

2. Injektion af frigivelsescocktail

BEMÆRK: Hele processen kan udføres inden for 20 min. Sørg for at udføre operationen under aseptiske forhold. Rengør alle overflader med antiseptisk middel (f.eks. 3% eller 6% hydrogenperoxid). Brug autoklaveret eller let sterilt værktøj, handsker, kjoler og gardiner.

1. Bedøv forsøgsdyret ved indånding af isofluran (2,5% til induktion og 2% til vedligeholdelse). Bekræft dybden af anæstesi ved at kontrollere hornhinderefleksen, reaktionen på stimuli (bagben og haleklemmetest) og vejrtrækningsmåden.
   BEMÆRK: Kirurgiske procedurer kan udføres under generel anæstesi induceret ved intraperitonealt injicerbar anæstesi (fx ketamin [40 mg / kg] og xylazin [10 mg / kg]). Dyb anæstesi blev bekræftet ved at kontrollere hornhinderefleksen, reaktionen på stimuli (bagben og haleklemmetest) og vejrtrækningsmåden.
2. Administrer analgesi subkutant (fx 0,3 mg / ml buprenorphin) ved induktion af anæstesi.
3. Monter rotten på den stereotaksiske ramme.
4. Barber pelsen på hovedet med en barbermaskine og rengør huden med antiseptisk, såsom 10% povidon-jodopløsning og derefter alkohol. Påfør antiseptisk middel tre gange ved hjælp af sterile vatpinde. Gnid i en cirkulær bevægelse i 3-5 s hver gang. Påfør øjensalve for at forhindre tørhed.
5. Lav et 2 cm snit i hovedets hud langs midterlinjen ved hjælp af en steril skalpel.
6. Ryd omhyggeligt kraniet ved hjælp af sterile vatpinde og sterilt saltvand.
7. Identificer bregma ved hjælp af kanten af kanylen på en 10 μL Hamilton sprøjte monteret på den stereotaksiske enhed. Indstil bregma som "punkt 0,0".
   BEMÆRK: Bregma identificeres som skæringspunktet mellem sagittale og koronale suturer. Flere detaljer kan findes i rottehjerneatlasset af Paxinos og Watson⁵.
8. Flyt enheden til koordinaterne anterioposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (for at målrette SEZ) eller AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (for at målrette CC).
9. Bor et 1 mm grathul ved hjælp af en tandboremaskine.
   BEMÆRK: Når du borer manuelt, skal du passe på ikke at skade den kortikale overflade. Blødningen forventes ikke at være betydelig. Ryd blod med saltvand og anvend tryk for at stoppe mere vedvarende blødning.
10. Læg 4 μL af frigørelsescocktailen i 10 μL Hamilton sprøjten.
11. Sænk kanylen (helst stump eller konisk kant) på Hamilton-sprøjten for at komme i kontakt med duraen.
12. Indsæt nålen i den ønskede dybde (D = 3,5 mm).
    BEMÆRK: Hæld saltvand på overfladen af dura for at holde vævet hydreret.
13. Der tilsættes 2 μL af frigørelsescocktailen med en hastighed på 1 μL/min.
14. Lad kanylen sidde i yderligere 2 minutter, før du langsomt trækker kanylen ud for at undgå overfladebehandling af frigørelsescocktailen.
15. Gentag trin 2.8-2.14 for den anden halvkugle ved koordinaterne AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (for at målrette SEZ) eller AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (for at målrette CC).
16. Sutur snittet med 5-0 nylon (diameter 0,1 mm) og rengør det suturerede område med antiseptisk middel.
17. Fjern masken, der leverer bedøvelsesmidlet, og overfør dyret til overvågningsområdet efter operationen.
    BEMÆRK: Genopretning fra anæstesi og vedligeholdelse af liggende skal ske inden for 5-10 minutter og fuld restitution (normal adfærd) inden for 25 minutter.
    1. Overvåg nøje genopretningen (levende og uafbrudt bevægelse, hyppig adgang til vand) i et godt opvarmet (24-25 ° C), stille rum uden småpartikelstrøelse, som kan blokere luftvejene. Returner dyret til selskabet af sine burkammerater (ikke til nye dyr) først efter at have bekræftet fuld genopretning.
    2. Overvåg dyret på vedligeholdelsesanlægget i mindst 48 timer efter operationen. Adresser tegn på smerte (skjulning af hovedet, unormal hoved- eller kropsholdning, overfølsomhed og hyperexcitabilitet over for håndtering) ved administration af analgesi (f.eks. 0,3 mg/ml buprenorphin, subkutant). Henvis dyr med misfarvet eller rejst pels til den ansvarlige dyrlæge.

3. Cerebrospinalvæske (CSF) flydende biopsi

BEMÆRK: Hele processen kan udføres inden for 10 min. Den her beskrevne flydende biopsi udføres 3 dage efter injektion af frigivelsescocktailen, men kan udføres på nøjagtig samme måde, når det er nødvendigt. Sørg for at udføre operationen under aseptiske forhold. Rengør alle overflader med antiseptisk middel (f.eks. 3% eller 6% hydrogenperoxid). Brug autoklaveret eller let sterilt værktøj, handsker, kjoler og gardiner.

1. Bedøv dyret ved indånding af isofluran (2,5% til induktion og 2% til vedligeholdelse). Bekræft dybden af anæstesi ved at kontrollere hornhinden
   refleks, reaktionen på stimuli (bagben og hale pinch test) og vejrtrækningsmåden.
   BEMÆRK: De kirurgiske procedurer kan udføres under generel anæstesi induceret ved intraperitonealt injicerbar anæstesi (fx ketamin [40 mg / kg] og xylazin [10 mg / kg]). Dette er dog ikke tilrådeligt, da proceduren er kort, især hvis biopsier vil blive udført flere gange på hinanden følgende dage.
2. Administrer analgesi subkutant (fx 0,3 mg / ml buprenorphin) ved induktion af anæstesi.
3. Monter forsøgsdyret på den stereotaksiske ramme. Brug ørestænger til at fastgøre hovedet uden at hindre rotationsbevægelse mod forsiden og bagsiden.
4. Stabiliser hovedet i en nedadgående 40° vinkel, så der kan opnås en god forlængelse af nakken.
   BEMÆRK: En måde at gøre dette på er ved at bruge enhedens mundstang⁶.
5. Barber pelsen i nakkeområdet ved hjælp af en barbermaskine og rengør huden med antiseptisk, såsom 10% povidon-jodopløsning og derefter alkohol. Påfør antiseptisk middel tre gange ved hjælp af sterile vatpinde. Gnid i en cirkulær bevægelse i 3-5 s hver gang.
6. Med fingerspidsen finder du det rombeformede depressible område placeret mellem den occipitale fremspring og rygsøjlen på atlas⁶.
7. Tegn et punktmærke (f.eks. ved hjælp af en markør).
8. Fastgør en 1 ml eller 0,5 ml sprøjte på stereotaksrammen.
   BEMÆRK: Det anbefales at bruge sprøjter med ikke-aftagelige nåle, da de giver bedre sugning og har mindre dødvolumen.
9. Anbring nålen ved kontaktpunktet med huden ved punktmærket.
10. Med et par tang løftes huden, mens sprøjten sænkes gennem hudlagene.
11. Hent stemplet lidt for at generere undertryk i sprøjten.
12. Genstart for at dyppe kanylen meget langsomt, indtil væske (CSF) kommer til syne i sprøjten.
13. Sæt nålen på denne position og lad den langsomme strøm af CSF.
    BEMÆRK: Nålen kan sænkes eller hæves lidt, hvis CSF-flowet er meget langsomt.
14. Start med at fjerne CSF langsomt (i trin på 40 μL / min) op til 120 μL.
15. Tag langsomt sprøjten op.
16. Intraperitonealt administrere 1 ml normalt serum for at understøtte forsøgsdyrets genopfyldning af væsker.
17. Den flydende biopsi (CSF) blandes med 400 μL NSC-substrat, og mikrocentrifugeglasset opbevares ved 4 °C indtil videre brug.
    BEMÆRK: Flydende biopsier skal behandles inden for 3 timer, hvis de ikke er frosne.
18. Fjern masken, der leverer bedøvelsesmidlet, og overfør dyret til overvågningsområdet efter operationen.
    BEMÆRK: Genopretning fra anæstesi og vedligeholdelse af liggende skal ske inden for 5-10 minutter og fuld restitution (normal adfærd) inden for 25 minutter.
    1. Overvåg nøje genopretningen (levende og uafbrudt bevægelse, hyppig adgang til vand) i et godt opvarmet (24-25 ° C), stille rum uden småpartikelstrøelse, som kan blokere luftvejene. Returner dyret til selskabet med sine burkammerater (ikke til nye dyr) først, når fuld genopretning er bekræftet.
    2. Overvåg dyret på vedligeholdelsesanlægget i mindst 48 timer efter operationen. Hvis der observeres tegn på smerte (hovedskjulning, unormal hoved- eller kropsholdning, overfølsomhed og hyperexcitabilitet over for håndtering), administreres analgesi (f.eks. 0,3 mg/ml buprenorphin subkutant). Henvis dyr med misfarvet eller rejst pels til den ansvarlige dyrlæge.

4. Behandling af væv til immunofluorescens

1. Aflive dyret ved intrakardieinfusion af 20 ml iskold saltvand efterfulgt af 50 ml iskold 4% paraformaldehyd (PFA; i fosfatbufret saltvand [PBS] med pH = 7,4).
2. Disseker hjernevævet.
   1. Adskil hovedet fra kroppen ved hjælp af en saks for at lave et snit i livmoderhalsområdet. Brug saksen til at fjerne huden og skær derefter kraniets knogle langs den sagittale midterlinje, med saksens spidser pegende opad for ikke at beskadige hjernevævet. Målet er at fortsætte med at skære så meget som muligt og passere koronal midterlinjen.
   2. Brug tang til at fjerne knoglerne, startende fra supraoccipital og parietal knogler og endelig frontale knogler.
   3. Når hjernevævet er afsløret, skal du bruge tangen eller en spatel til at løfte det ud af kraniet. For at lette dette skal du skære nerverne i bunden af hjernen og de olfaktoriske pærer, hvis det ikke ønskes.
3. Efterfiksering af vævet natten over i 2 % PFA ved 4 °C.
4. Kryobeskyt vævet i 30 % saccharose (i PBS) i mindst 48 timer ved 4 °C, indtil vævet synker til bunds.
5. Vævet fryses ved -80 °C.
6. Skær hjernevævet i 14 μm tykke koronale sektioner med en kryostat.
7. Udfør immunfluorescensfarvning ved hjælp af standardprotokoller ^3,7
   1. Inkuber sektionerne med blokerende buffer (3% bovin serumalbumin [BSA], 0,1% Triton X-100, i PBS) i 2 timer ved stuetemperatur.
   2. Udfør antigenhentning (kogning i 15 minutter i 10 mM citratbuffer, pH = 6,0 ved hjælp af glasbeholdere).
      BEMÆRK: Dette trin er valgfrit, men nødvendigt for nukleare antigener.
   3. Bring til stuetemperatur og inkuber med primære antistoffer mod glialfibrillært surt protein (GFAP), doublecortin (Dcx), S100β og β-catenin (se materialetabellen) i blokerende buffer natten over ved 4 ° C.
   4. Der inkuberes i 2 timer med sekundære antistoffer i PBS med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til nuklear modfarvning ved stuetemperatur (se materialetabellen).
   5. Monter dækslerne.

5. Behandling af isolerede celler til immunofluorescens

1. Pladerne i 96-brønds plader, der er kompatible til mikroskopi, belagt med poly-D-lysin (100 μg / ml).
2. Fastgør cellerne i iskold 2% PFA i 10 min og vask 3x med PBS.
3. Udfør immunfluorescens ved hjælp af standardprocedure^3,7 for PDGFRα, GFAP^, Dcx, SOX2 og ID3 (se materialetabellen).
4. Opbevar cellerne i PBS +_NaN3 (0,1%) ved 4 °C i mørke.

6. Mikroskopi og billedanalyse

1. Tag billeder ved hjælp af epifluorescens eller konfokal mikroskopi og udfør celletællinger ved hjælp af standard billedanalysesoftwareværktøjer, såsom celletællere.

Frigivelse og indsamling af NSC'er
NSC'er i SEZ adskilles kun fra CSF ved monolaget af ependymale celler, omend de forbliver i direkte kontakt med ventrikulært indhold via interkalerende monocilierede processer ^8,9. Neuraminidase virker specifikt på ependymale celler via spaltning af sialinsyrerester og kan inducere denudation af ventrikelvæggen. Dette fører til neuroblastklyngedannelse på overfladen af ventriklen^10,11. Desuden er der observeret en strøm af neuroblaster i CSF efter icv-injektion af et integrin-β1-blokerende antistof, sandsynligvis på grund af løsningen af de inter-ependymale cellekrydsninger¹². Disse observationer har ført til udviklingen af en protokol, der muliggør isolering af hjernens stamceller og stamceller via kontrolleret kompromis med integriteten af den laterale ventrikels vægge. I et første trin induceres frigivelsen fra parenchymen og den efterfølgende strøm af NSC'er eller OPC'er inde i CSF via i.c.v. injektion af frigivelsescocktailen. Cocktailen injiceres stereotaksisk med en hastighed på 1 μL/min, bilateralt (2 μL pr. injektion) i de laterale ventrikler (koordinater rettet mod SEZ NSC'er: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; koordinater rettet mod CC OPC'er: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). Det andet ("indsamling") trin involverer udførelsen af CSF flydende biopsier fra cisterna magna. Rotterne skal bedøves, og biopsien kan udføres med 1 ml sprøjter. Brugen af den stereotaxiske enhed tillader næsten fuldstændig succes med at hente ca. 100 μL CSF uden behov for snit. Den flydende biopsi tilsættes til isdyrkningsmedium og opbevares ved 4 °C indtil plettering i <3 timer (NSC-dyrkningsmedium indeholder Dulbeccos modificerede Eagle-medium [DMEM], B27-supplement [2%], N2-supplement [1%], FGF2 [20 ng/ml] og epidermal vækstfaktor [EGF; 20 ng/ml]).

Histologisk vurdering af det periventrikulære område efter injektion af frigivelsescocktailen
En første kohorte af eksperimenter afslørede, at ventriklerne ved injektion af mere end 3 μL væske kunne blive beskadiget på grund af ikke-specifik, mekanisk skade (figur 2B, C). Den langsomme injektion af 2 μL frigivelsescocktail førte til fremkomsten af klynger af Dcx-immunopositive neuroblaster på ventrikulær overflade. Disse klynger forblev synlige selv 8 måneder efter injektion (figur 2D). Da metoden var beregnet til longitudinelle undersøgelser med henblik på langsigtet opfølgning af dyrene, blev vævsskaden forårsaget af frigivelsescocktailen vurderet. Immunfarvning blev udført på 14 μm tykke kryostathjernesektioner for ependymale cellemarkører, såsom S100β og β-catenin¹³, og den samlede integritet af ependymalaget blev vurderet. Denudationssteder for det ependymale lag var kun til stede tæt på injektionernes rostrokaudale niveau, med et gradvist fald i forstyrrelser i ependymale lag påvist i mere bageste og mere forreste områder af SEZ (figur 2E, F) og blev fraværende efter en afstand på ±2 mm fra injektionsstedet. Ovennævnte resultater viser, at den delvise denudation af det ependymale lag forårsaget af i.c.v. injektion af frigivelsescocktailen er fokal, fastholdt i nærheden af injektionsstedet og efterlader resten af det periventrikulære ependymale lag intakt.

Markørprofil og in vitro-opførsel af indsamlede celler
Derefter blev in vitro-adfærden og markørprofilen for cellerne isoleret via malkeprotokollen vurderet. Det gennemsnitlige celleudbytte af hver flydende biopsi er ca. 300 ± 45 celler (pr. biopsi på 100 μL)⁷. Malkebiopsier resulterede i NSC-kulturer med et gennemsnit på 3,17 ± 0,45 passagepotentiale. Celler isoleret fra saltvandsinjicerede rotter kunne passeres i gennemsnit 1,92 ± 0,76 gange; i modsætning hertil nåede de, der blev isoleret via malkning, endda ni passager (p = 0,038, t test) (figur 3A)⁷. Den gennemsnitlige overførselskapacitet for standard postmortem, SEZ-afledte neurosfærekulturer er højere end 12 passager i vores hænder. Fordi in vivo-ekspansionspotentialet for SEZ NSC'er, som afsløret ved in vivo-celleskæbnekortlægningsforsøg ¹⁴, har vist sig at være begrænset, producerer malkning celler med signifikant anderledes in vitro-adfærd end celler i standardkulturer, omend meget tættere på adfærden hos endogene NSC'er. Indsamlede celler blev belagt på poly-D-lysinbelagte brønde, hvor de voksede både som klæbende monolag og sjældnere som neurosfærer (figur 3B). Nyligt isolerede celler (indsamlet 3 dage efter injektion og fikseret 24 timer efter plettering), der var immunpositive for den astrogliale markør GFAP, var også immunpositive for ID3, en markør for hvile, og havde karakteristikken for NSC bipolar morfologi (figur 3C). Som tidligere rapporteret⁷ viste en mere detaljeret immunocytokemisk sammenligning af biopsiafledte celler og postmortemafledte celler fra de samme dyr 3 dage efter injektion (på udkig efter GFAP + astrocytter, Dcx + neuroblaster, PDGFRa + oligodendrocytforfædre og SOX2 + celler i den neurale afstamning), at profilen af indsamlede celler svarede til profilen for endogene SEZ-celler (figur 3D). Især når biopsi- og vævsafledte celler blev sammenlignet under forskellige forhold (f.eks. injektion af en frigivelsescocktail med og uden FGF2), blev det fundet, at vækstfaktoren resulterede i en samtidig og signifikant stigning i tilstedeværelsen af SOX2+-celler samt i et signifikant fald i tilstedeværelsen af Dcx+ neuroblaster i begge prøver (figur 3D). Disse data bekræftede, at eventuelle ændringer, der optræder i profilen for endogene populationer af NSC'er, afspejles i malkegenererede celleprøver.

Figur 1: Grafisk oversigt over malkning. En koronal sektion af en hjernehalvkugle med de store anatomiske landemærker (den laterale ventrikel, det overliggende corpus callosum og den forreste kommission nedenfor [hvide stofkanaler i gråt] og den subependymale zone ved sidevæggene [i blå]). Frigivelsescocktailen injiceres i den laterale ventrikel, hvilket fører til kompromis med vævets integritet og frigivelse af postnatale hjerneneurale stamceller i cerebrospinalvæsken, hvorfra de kan opsamles via flydende biopsier. Forkortelser: SEZ = subependymal zone; LV = lateral ventrikel; CSF = cerebrospinalvæske; pbNSC'er = postnatale hjerne neurale stamceller; β1-int = beta1 integrin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Histologisk vurdering af virkningerne af icv-injektioner. (A-D) Billeder med lav forstørrelse af den dorsale halvdel af den laterale ventrikel efter immunfarvning for Dcx (i rødt, for at markere neuroblaster). (A) Den enkle i.c.v. indsættelse af en Hamilton sprøjte forstyrrer ikke cytoarkitekturen i SEZ, mens icv injektion af 10 ml (infusionshastighed på 1 ml / min) fører til alvorlig skade på ventrikelvæggen uanset dens indhold. (B) saltvand og (C) frigivelsescocktail. (D) Injektion af 2 μL frigørelsescocktail fører til en kontrolleret kompromittering af ventrikelvæggen, observeret selv 8 måneder efter operationen. Højere forstørrelsesdetaljer af væggen i SEZ 7 og 14 dage efter injektion er vist i henholdsvis (E) og (F). Der er en uorganiseret struktur med Dcx + neuroblaster (i grønt), der hviler på overfladen af væggen, og de andre celler i nichen (Sox2+, i hvid) hviler dybere. Det periventrikulære væv beskadiges på injektionens rostrokaudale niveau ved 2 måneders tidspunktet (i G), mens vævet er intakt på et mere kaudale niveau (i H) i det samme dyr. Ventrikelvæggen vurderes ved immunfarvning for ependymale markører S100β og β-catenin. Detalje af murens typiske arkitektur er vist i (I). Nuklear farvning udføres ved hjælp af DAPI (vist i blåt). Skalastænger = 300 μm (A-C,G,H, indsatser), 150 μm (D), 30 μm (E,F) og 50 μm (I). Dette tal er modificeret fra McClenahan et ^al.13. Forkortelser: SEZ = subependymal zone; i.c.v = intracerebroventricular; Dcx = dobbeltcortin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Vurdering af cellerne isoleret via malkning. (A) Graf, der viser det maksimale antal passager opnået pr. flydende biopsiprøve fra saltvandsinjicerede dyr (grå bjælker, i alt 12 prøver) eller efter malkning (sorte bjælker, i alt 29 prøver, frigivelse af cocktail med neuraminidase og integrin-β1-blokerende antistof). B) Repræsentativt konfokalmikroskopibillede af primærceller opnået ved malkning 3 dage efter injektion, immunfarvet mod GFAP og ID3. (C,D) Brightfield-billeder af celler isoleret 3 dage efter injektion, belagt på poly-D-lysinbelagte brønde og lov til at vokse i NSC-spredningsmedium i 7 dage. E) Graf, der viser celletypeprofilen for celler, der er isoleret ved malkning af SEZ, og for den endogene population af SEZ NSC'er fra de samme forsøgsdyr. SOX2+ og Dcx+ fraktionerne blev signifikant henholdsvis øget og reduceret efter samtidig injektion af FGF2. (Envejs ANOVA analyse pr. markør, efterfulgt af post hoc analyse; n = 4-6 dyr pr. forsøgsgruppe.) Skalastænger = 100 μm (C,D) og 10 μm (B). Dette tal er modificeret fra McClenahan et ^al.13. Forkortelser: SEZ = subependymal zone; DPI = dage efter injektion; NSC = neurale stamceller; Dcx = dobbeltcortin; GFAP = glialfibrillært surt protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Stamceller og stamceller er relativt sparsomme i pattedyrs hjernevæv. Derudover er NSC'er placeret i områder, der er utilgængelige for nemme og sikre biopsier (ventrikulære vægge, hippocampus). Derfor har den eneste måde at arbejde eksperimentelt med sådanne celler hidtil været deres postmortemisolering. En metode, der tillader enkelt eller gentagen indsamling af NSC'er og OPC'er fra levende rotter, kaldet malkning, beskrives her trin for trin. Metoden er baseret på to nøglefunktioner: i) NSC'er eller OPC'er adskilles af det ependymale cellemonolag fra CSF, der strømmer inden for hjernens ventrikulære system; ii) ependymale celler og neurale forfædre bevarer kontakten mellem dem og med andre nærliggende celletyper via integriner. Derfor indeholder frigivelsescocktailen, der injiceres i specifikke områder af ventriklerne for at muliggøre frigørelse af NSC'er eller OPC'er fra hjernens parenchyma, neuraminidase, et toksin, der specifikt målretter og dræber ependymale celler^10,11 og et integrin-β1-blokerende antistof. Den indeholder også FGF2, da denne vækstfaktor er afgørende for overlevelse og vedligeholdelse af NSC'er i nichen og i kultur^15,16. Det er tidligere blevet vist⁷, at denne protokol tolereres godt af dyrene; I denne rapport bekræftes det yderligere, at skaden på ependymale celler, fremkaldt af frigivelsescocktailen som en forudsætning for frigivelse af NSC'er/OPC'er i CSF, er begrænset omkring injektionens rostrokaudale niveau. Dette har været af afgørende betydning, da protokollen bør bevare hjernens homeostatiske funktion, herunder selve stamcellenichen, og ikke bør bringe dyrenes langsigtede velfærd i fare. Den stereotaksiske injektion af frigivelsescocktailen er af mild sværhedsgrad og har aldrig resulteret i døden. Desuden er udførelsen af flydende biopsier fra cisterna magna en hurtig og minimalt invasiv procedure, der kan gentages flere på hinanden følgende gange.

Det er vigtigt, at NSC-prøverne isoleret via malkning nøje afspejler den endogene pulje af NSC'er. Profilen af SEZ-forfædre kan påvirkes af icv-injektionen af FGF2. Når dette sker, påvirkes profilen af malkeafledte celler på samme måde. Desuden har tidligere eksperimentelt arbejde indikeret, at NSC'er isoleret via malkning af SEZ har begrænset selvfornyelsespotentiale, en adfærd svarende til endogene NSC'er som afsløret med in vivo, transgene, celleskæbnestrategier^14,17. Postnatal hjerne NSC'er bevares i hvile, sjældent transit mod mitotisk aktivering for at generere neurogen og gliogen afkom^18,19,20. Her fremlægges bevis for, at den brøkdel af malkeafledte celler, der udtrykker GFAP og forventes at omfatte bona fide NSC'er, co-udtrykker ID3, en markør for hvilende NSC'er²¹. Den berigede tilstedeværelse af hvilende NSC'er, som derefter belægges i NSC-mediet, der typisk anvendes til dyrkning af NSC'er isoleret post mortem, synes at begrænse ekspansionspotentialet for indsamlede NSC'er (f.eks. En proces, der er afgørende, hvis celler skulle bruges til autologe transplantationer). Dette skyldes, at disse medier er designet specielt til overlevelse og mitotisk ekspansion af aktiverede NSC'er; Genereringen af protokoller, der muliggør effektiv og hurtig mitotisk aktivering af hvilende NSC'er, vil således øge værdien og anvendelsesområdet for malkning.

Samlet set indikerer disse data, at malkning muliggør prøveudtagning af postnatale hjerne-NSC'er og OPC'er (afhængigt af det rostrokaudale niveau af injektion af frigivelsescocktailen) fra levende rotter. Dette arbejde indikerer muligheden for at udføre successive flydende biopsier i samme dyr, selv ved betydelige tidslængder efter injektion af frigivelsescocktailen (således at planlægge og udføre langsgående eksperimentelle undersøgelser), da neuroblaster forbliver grupperet på ventrikulære vægge selv 8 måneder efter injektion. Sådanne metoder er af afgørende betydning, fordi de gør det muligt at undersøge begivenheder inden for de enkelte dyr, der resulterer i reduceret biologisk støj genereret af fysiologisk variation. Dette fører igen til forbedret nøjagtighed og til implementering af principperne i "3R'erne" (udskiftning, reduktion og forfining). Fremtidige vigtige skridt til forbedring af metoden vil være bestemmelsen af det maksimale antal og tidsrammen, hvor flydende biopsier kan udføres efter en frigivelsesprocedure, selv om det om nødvendigt bør være muligt at udføre yderligere frigivelsesprocedurer.